【摘要】：背景:近年來中醫(yī)藥對缺血性心肌病的研究1經進入分子和基因水平,大量的實驗證明,針刺對改善心肌缺血的效果良好,且隨著基因芯片以及二代測序、生物信息分析等技術的應用,基礎動物實驗和臨床試驗的研究成果取得了很大進展。然而限于各種客觀因素影響,臨床試驗與基礎動物實驗研究之間有較大區(qū)別,特別是物種間差異導致動物模型的結果難以應用到臨床。據我們了解,目前為止還沒有對動物實驗和臨床試驗進行有效的比對分析的研究,更沒有人提出將二者結合進行數據處理的方案。這對于臨床和實驗的互相促進是巨大的障礙!目的:比較人和大鼠間針刺對心肌缺血疾病的基因譜調控信息的異同點,通過生物信息學技術分析針刺對心肌缺血性疾病治療機制的關鍵基因以及通路,以期在利用動物模型進行人類疾病研究時,能為臨床試驗研究方案的確定和動物模型的開發(fā)提供可行的指導。方法:數據來源于基于本課題組針刺內關穴治療心肌缺血疾病的臨床試驗(外周血中性粒細胞)和動物實驗(缺血邊緣心肌組織)高通量測序后的原始數據,通過生物信息學方法分析處理,篩選出針刺前后基因表達差異倍數較高的基因群(判斷標準log2(fold-change,FC)|±1|,≥1為上調,≤-1為下調),然后尋找出共同調控的基因,比較二者異同,使用DAVID對進行基因功能注釋,并在此基礎上進行KEGG_PATHWAY通路分析,使用String分析和預測蛋白質-蛋白質相互作用網絡,過濾和評估功能性基因組學的數據,提供跨物種預測。結果:針刺后不同種屬實驗對象共同上調的差異表達關鍵基因178個,共同下調20個。Pathway分析上調的信號通路,發(fā)現主要差異基因都集中在線粒體、氧化還原、氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)、穩(wěn)態(tài)過程、核糖體、炎癥和免疫因子等方面。這個現象說明了針刺增強了心肌細胞缺血后的線粒體功能,開放了能量和氧化還原反應,提高了穩(wěn)態(tài)過程,從而糾正了由于心肌缺血破壞的線粒體穩(wěn)態(tài)平衡、ATP合成減少、ROS生成增加、線粒體片段化、膜通透性變化。此外還有心肌收縮、肥厚型心肌病(HCM)、擴張型心肌病相關基因,在缺血的心肌組織中顯著降低,而電針治療后明顯增加。雖然下調的這20個基因并沒有形成特定的通路,但是其中包含的MAP3K2、MMP9等基因都有報道與心肌缺血密切相關。結論:線粒體能量代謝、氧化還原反應、心肌細胞穩(wěn)態(tài)平衡,炎癥反應,心肌收縮等相關通路的基因在針刺內關穴治療心肌缺血疾病的臨床試驗和動物實驗中具有可靠的一致性改變,TNNT2、ACTC1、ATP2A2、TNNC1、MYH6、TPM1等基因在針刺內關穴改善心肌缺血的機制中起到重要作用,在以后的實驗室研究和臨床研究中可以作為重要參考。但是臨床試驗中表現很突出的CXCR2、IL1R2等免疫相關基因并未在動物實驗中發(fā)現有統計學意義的變化,而與其相關的XCL1、CCR10、CXCL、CCR10等相關的基因發(fā)生了明顯改變,說明臨床心肌缺血疾病的形成伴隨著長期的炎癥過程,而動物疾病通過手術結扎快速造模,病理特征更多的表現在心肌細胞的快速應激,能量的氧化代謝方面,所以我們建議以后的動物實驗應該做出調整,選擇更加貼近臨床病理形成的特征來造模。
【圖文】：

注：－ｏ指定輸出文件路徑，－ｆ強制指定輸入文件格式，如：ｆａｓｔｑ，ｂａｍ，ｓａｍ逡逑（默認會自動檢測文件格式），此外，使用－ｔ邋（ｔｈｒｅａｄｓ）使用多線程處理，每逡逑個線程大約占２５０ＭＢ內存（不能在３２位系統上運行超過６線程），加上－ｑ參逡逑數則進入安靜模式，不提示任務完成進度。生成的質量報告結果（圖一所示）逡逑為一個ＨＴＭＬ的網頁的ｚｉｐ壓縮包文件，包括測序數據的基本信息、每個堿逡逑基的質量值、每條ｒｅａｄｓ序列的質量值、每條序列的ＡＴＣＧ組成、每條）予列Ｎ逡逑的含量、每條序列的長度分布、序列中ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ程度、Ｋ－ｍｅｒ信息等。部分逡逑結果如圖１－４所示。逡逑９逡逑

２．數據處理方法與關鍵過程逡逑２．１邋ＣｈＩＰ－ｓｅｑ數據分析逡逑染色質免疫共沉淀后測序（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ邋Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ邋ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）逡逑包括染色質免疫共沉淀（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅ－ｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＣｈＩＰ）實驗和高通量測逡逑序（Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）兩個部分。數據基本處理包括：①數據預處理、逡逑②ｒｅａｄｓ序列比對定位、③富集區(qū)（峰）識別，及④后續(xù)處理。分析流程如圖２．１逡逑所示。逡逑其中序列比對是ＣｈＩＰ－ｓｅｑ分析流程中使用計算資源最大一步，是數據分析逡逑的最重要過程，涉及幾種不同思路的算法（１）空位種子片段索引法：包括ＥＬＡＮＤ、逡逑ＭＡＱ［５２］等軟件，（２）邋ＢＷ邋（Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ）轉換算法：ＢＷＡ［５３］、Ｂｏｗｔｉｅ［５４］、逡逑ＳＯＡＰ２［５５］等，各軟件各有優(yōu)劣。搜峰〔ｐｅａｋｃａｌｌｉｎｇ〕，即基因富集區(qū)域（ｐｅａｋ，峰）逡逑的識別，常用搜峰軟件如ＭＡＣＳ［５６］，，邋Ｐｅａｋｓｅｑ［５７］，ＺＩＮＢＡ＿等。適用于分析ｓｈａｒｐ逡逑ｐｅａｋ的代表性軟件主要有ＭＡＣＳ，分析ｂｒｏａｄ邋ｐｅａｋ的代表性搜峰軟件有ＳＩＣＥＲ逡逑
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R245

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

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本文編號：2649299