【摘要】：背景:近年來(lái)中醫(yī)藥對(duì)缺血性心肌病的研究1經(jīng)進(jìn)入分子和基因水平,大量的實(shí)驗(yàn)證明,針刺對(duì)改善心肌缺血的效果良好,且隨著基因芯片以及二代測(cè)序、生物信息分析等技術(shù)的應(yīng)用,基礎(chǔ)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)的研究成果取得了很大進(jìn)展。然而限于各種客觀因素影響,臨床試驗(yàn)與基礎(chǔ)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究之間有較大區(qū)別,特別是物種間差異導(dǎo)致動(dòng)物模型的結(jié)果難以應(yīng)用到臨床。據(jù)我們了解,目前為止還沒(méi)有對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)進(jìn)行有效的比對(duì)分析的研究,更沒(méi)有人提出將二者結(jié)合進(jìn)行數(shù)據(jù)處理的方案。這對(duì)于臨床和實(shí)驗(yàn)的互相促進(jìn)是巨大的障礙!目的:比較人和大鼠間針刺對(duì)心肌缺血疾病的基因譜調(diào)控信息的異同點(diǎn),通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)分析針刺對(duì)心肌缺血性疾病治療機(jī)制的關(guān)鍵基因以及通路,以期在利用動(dòng)物模型進(jìn)行人類(lèi)疾病研究時(shí),能為臨床試驗(yàn)研究方案的確定和動(dòng)物模型的開(kāi)發(fā)提供可行的指導(dǎo)。方法:數(shù)據(jù)來(lái)源于基于本課題組針刺內(nèi)關(guān)穴治療心肌缺血疾病的臨床試驗(yàn)(外周血中性粒細(xì)胞)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(缺血邊緣心肌組織)高通量測(cè)序后的原始數(shù)據(jù),通過(guò)生物信息學(xué)方法分析處理,篩選出針刺前后基因表達(dá)差異倍數(shù)較高的基因群(判斷標(biāo)準(zhǔn)log2(fold-change,FC)|±1|,≥1為上調(diào),≤-1為下調(diào)),然后尋找出共同調(diào)控的基因,比較二者異同,使用DAVID對(duì)進(jìn)行基因功能注釋,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行KEGG_PATHWAY通路分析,使用String分析和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),過(guò)濾和評(píng)估功能性基因組學(xué)的數(shù)據(jù),提供跨物種預(yù)測(cè)。結(jié)果:針刺后不同種屬實(shí)驗(yàn)對(duì)象共同上調(diào)的差異表達(dá)關(guān)鍵基因178個(gè),共同下調(diào)20個(gè)。Pathway分析上調(diào)的信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)主要差異基因都集中在線(xiàn)粒體、氧化還原、氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)、穩(wěn)態(tài)過(guò)程、核糖體、炎癥和免疫因子等方面。這個(gè)現(xiàn)象說(shuō)明了針刺增強(qiáng)了心肌細(xì)胞缺血后的線(xiàn)粒體功能,開(kāi)放了能量和氧化還原反應(yīng),提高了穩(wěn)態(tài)過(guò)程,從而糾正了由于心肌缺血破壞的線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)平衡、ATP合成減少、ROS生成增加、線(xiàn)粒體片段化、膜通透性變化。此外還有心肌收縮、肥厚型心肌病(HCM)、擴(kuò)張型心肌病相關(guān)基因,在缺血的心肌組織中顯著降低,而電針治療后明顯增加。雖然下調(diào)的這20個(gè)基因并沒(méi)有形成特定的通路,但是其中包含的MAP3K2、MMP9等基因都有報(bào)道與心肌缺血密切相關(guān)。結(jié)論:線(xiàn)粒體能量代謝、氧化還原反應(yīng)、心肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡,炎癥反應(yīng),心肌收縮等相關(guān)通路的基因在針刺內(nèi)關(guān)穴治療心肌缺血疾病的臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有可靠的一致性改變,TNNT2、ACTC1、ATP2A2、TNNC1、MYH6、TPM1等基因在針刺內(nèi)關(guān)穴改善心肌缺血的機(jī)制中起到重要作用,在以后的實(shí)驗(yàn)室研究和臨床研究中可以作為重要參考。但是臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)很突出的CXCR2、IL1R2等免疫相關(guān)基因并未在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化,而與其相關(guān)的XCL1、CCR10、CXCL、CCR10等相關(guān)的基因發(fā)生了明顯改變,說(shuō)明臨床心肌缺血疾病的形成伴隨著長(zhǎng)期的炎癥過(guò)程,而動(dòng)物疾病通過(guò)手術(shù)結(jié)扎快速造模,病理特征更多的表現(xiàn)在心肌細(xì)胞的快速應(yīng)激,能量的氧化代謝方面,所以我們建議以后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)該做出調(diào)整,選擇更加貼近臨床病理形成的特征來(lái)造模。
【圖文】：

注：－ｏ指定輸出文件路徑，－ｆ強(qiáng)制指定輸入文件格式，如：ｆａｓｔｑ，ｂａｍ，ｓａｍ逡逑（默認(rèn)會(huì)自動(dòng)檢測(cè)文件格式），此外，使用－ｔ邋（ｔｈｒｅａｄｓ）使用多線(xiàn)程處理，每逡逑個(gè)線(xiàn)程大約占２５０ＭＢ內(nèi)存（不能在３２位系統(tǒng)上運(yùn)行超過(guò)６線(xiàn)程），加上－ｑ參逡逑數(shù)則進(jìn)入安靜模式，不提示任務(wù)完成進(jìn)度。生成的質(zhì)量報(bào)告結(jié)果（圖一所示）逡逑為一個(gè)ＨＴＭＬ的網(wǎng)頁(yè)的ｚｉｐ壓縮包文件，包括測(cè)序數(shù)據(jù)的基本信息、每個(gè)堿逡逑基的質(zhì)量值、每條ｒｅａｄｓ序列的質(zhì)量值、每條序列的ＡＴＣＧ組成、每條）予列Ｎ逡逑的含量、每條序列的長(zhǎng)度分布、序列中ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ程度、Ｋ－ｍｅｒ信息等。部分逡逑結(jié)果如圖１－４所示。逡逑９逡逑

２．?dāng)?shù)據(jù)處理方法與關(guān)鍵過(guò)程逡逑２．１邋ＣｈＩＰ－ｓｅｑ數(shù)據(jù)分析逡逑染色質(zhì)免疫共沉淀后測(cè)序（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ邋Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ邋ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）逡逑包括染色質(zhì)免疫共沉淀（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅ－ｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＣｈＩＰ）實(shí)驗(yàn)和高通量測(cè)逡逑序（Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）兩個(gè)部分。數(shù)據(jù)基本處理包括：①數(shù)據(jù)預(yù)處理、逡逑②ｒｅａｄｓ序列比對(duì)定位、③富集區(qū)（峰）識(shí)別，及④后續(xù)處理。分析流程如圖２．１逡逑所示。逡逑其中序列比對(duì)是ＣｈＩＰ－ｓｅｑ分析流程中使用計(jì)算資源最大一步，是數(shù)據(jù)分析逡逑的最重要過(guò)程，涉及幾種不同思路的算法（１）空位種子片段索引法：包括ＥＬＡＮＤ、逡逑ＭＡＱ［５２］等軟件，（２）邋ＢＷ邋（Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ）轉(zhuǎn)換算法：ＢＷＡ［５３］、Ｂｏｗｔｉｅ［５４］、逡逑ＳＯＡＰ２［５５］等，各軟件各有優(yōu)劣。搜峰〔ｐｅａｋｃａｌｌｉｎｇ〕，即基因富集區(qū)域（ｐｅａｋ，峰）逡逑的識(shí)別，常用搜峰軟件如ＭＡＣＳ［５６］，，邋Ｐｅａｋｓｅｑ［５７］，ＺＩＮＢＡ＿等。適用于分析ｓｈａｒｐ逡逑ｐｅａｋ的代表性軟件主要有ＭＡＣＳ，分析ｂｒｏａｄ邋ｐｅａｋ的代表性搜峰軟件有ＳＩＣＥＲ逡逑
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R245

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2649299