【摘要】：核桃舉肢蛾(Atrijuglans hetaohei Yang)屬鱗翅目、織蛾科、黑展足蛾屬,是嚴(yán)重危害核桃果實的一種主要的蛀果類害蟲。國內(nèi)外學(xué)者對核桃舉肢蛾的研究大多集中在生活史,田間危害、防控技術(shù)及觸角局部特征等方向。為了解核桃舉肢蛾成蟲存在的神經(jīng)肽種類及分布情況,本試驗利用課題組獲得的核桃舉肢蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出8條候選內(nèi)參基因,應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)篩選了舉肢蛾不同發(fā)育時期、性別和在幼蟲不同組織樣品中最適內(nèi)參基因及數(shù)目;利用舉肢蛾頭部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),鑒定出32個神經(jīng)肽基因,40個神經(jīng)肽受體基因,并通過熒光定量分析了部分神經(jīng)肽基因及神經(jīng)肽受體在不同性別、不同組織中的表達(dá)情況,主要研究結(jié)果如下:1核桃舉肢蛾內(nèi)參基因篩選及最適內(nèi)參基因數(shù)目的確定從核桃舉肢蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定分析得到8條常用于篩選內(nèi)參參照的基因,分別為GAPDH、β-Tubulin、TBP、Histone、UBC、AK、28S和ELF,利用熒光定量PCR檢測了各基因在蟲體不同發(fā)育階段、不同性別中的表達(dá),利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在線軟件RefFiner分析各基因的表達(dá)穩(wěn)定性:在核桃舉肢蛾不同發(fā)育時期和性別中,各候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性由高到低分別為GAPDH28ShistoneTBPELFUBC9AKβ-Tubulin,若采用多內(nèi)參進(jìn)行數(shù)據(jù)的校正,則需要選擇GAPDH和28S兩個基因;不同組織部位中,各內(nèi)參基因穩(wěn)定性為28ShistoneTBPGAPDHAKELFUBC9β-Tubulin,若采用多內(nèi)參進(jìn)行數(shù)據(jù)的校正,則需要28S、histone和TBP三個基因。2核桃舉肢蛾成蟲頭部神經(jīng)肽及受體基因的鑒定利用舉肢蛾頭部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)查找神經(jīng)肽及受體基因,而后經(jīng)tBlastx進(jìn)行同源序列比對,篩選得到32個神經(jīng)肽基因,其中包含神經(jīng)肽AKH1、AT、DH31、DH45、FMRF、ITG、Ork、PBAN、Pro、SIF、sNPF、TK等12條具有完整的開放閱讀框;AKH2、AstB、CAPA、CCH2、PTTH、Bur、CRF、ETH、LK、NPFb等10條序列具有5'非編碼區(qū);CCH1、MS、NP和NPLP1具有3'非編碼區(qū)。40個神經(jīng)肽受體基因中,A1、A4、A10、A12、A13、A15、A20、A23、A26等9條序列具有完整的開放閱讀框,NPYR和SPR1具有5'非編碼區(qū);Ast R、DHR、NPR、MCHR、INR、A7、A8、A11、A17、A27、A29、A30、A31、A32、Thyrotropin-releasing hormone Receptor等15條序列具有3'非編碼區(qū)。3神經(jīng)肽及受體基因在核桃舉肢蛾不同組織中的表達(dá)通過RT-qPCR方法定量分析舉肢蛾22條神經(jīng)肽及22條受體基因在核桃舉肢蛾不同性別及組織中的表達(dá),AKH1、AstB、CCH1、CCH2、CCAP、ITG、ETH、MS、OKA、PTTH等基因在雄成蟲頭部表達(dá)量最高,明顯高于胸部和腹部;NP、FMRF、PTTH等基因在雄成蟲腹部表達(dá)量高;Bur、CAPA、DH31、NPLP1、PBAN、SIF等基因在雌成蟲表達(dá)量高,其中Bur在雌成蟲腹部表達(dá)量高,NPLP1、PBAN和SIF在雌成蟲頭部表達(dá)量均明顯高于雄成蟲;神經(jīng)肽受體A6-A、A8、A9、A11、A12等9個受體基因在雄成蟲頭部的表達(dá)量明顯高于雌成蟲,A1、A4、A10、A13在成蟲腹部中表達(dá)量高于頭部和胸部,且在雄蛾中的表達(dá)量高于雌蛾;A20在頭部和腹部中的表達(dá)量明顯高于胸部;A24在雌蛾頭部中表達(dá)量最高;DHR在雌蛾胸部表達(dá)量最高。本研究確定了不同發(fā)育階段、不同組織RT-qPCR的最適內(nèi)參基因和最適內(nèi)參基因數(shù)目,鑒定和分析了存在于核桃舉肢蛾成蟲頭部的多條神經(jīng)肽和受體基因,并定量分析了神經(jīng)肽和受體基因在核桃舉肢蛾成蟲不同組織的表達(dá)情況,為進(jìn)一步深入研究核桃舉肢蛾發(fā)育、生理信號調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

-TUB、ELF、GAPDH、Histone、TBP、28S、UBC9 的斜率及擴(kuò)增效率，如表 2-2 所 個內(nèi)參基因的斜率均在-3 - -3.5 之間，線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于 0.9800，擴(kuò)增效率2％-115％。表 2-2 8 個內(nèi)參候選基因的相關(guān)參數(shù)Table2-2 The parameters derived from RT- qPCR analysis of 8 candidate reference genes基因名稱Gene name擴(kuò)增效率Efficieny（%）斜率slope相關(guān)系數(shù)Correlation RAK 114% -3.0274 0.9942β-TUB 92.8% -3.5063 0.9891ELF 103.4% -3.2422 0.9917GAPDH 96.9% -3.3983 0.9816Histone 95.1% -3.4448 0.982TBP 112.4% -3.0562 0.990328S 113.1% -3.0429 0.996UBC9 112.8% -3.0495 0.995

基因表達(dá)穩(wěn)定性分析舉肢蛾的每個樣品均進(jìn)行了 3 次技術(shù)學(xué)重復(fù)和 3 次生物學(xué)重復(fù)，后原始 Ct 均值進(jìn)行分析。在所有樣本中，，每個基因的平均 Ct 值的分同性別和發(fā)育時期條件下 8 個內(nèi)參基因的 Ct 值的分布在 18.94（TBAK 的 Ct 值）之間；不同發(fā)育時期中 8 個內(nèi)參基因的 Ct 值分布在 到 29.74（histone 的 Ct 值）之間。Norm 程序?qū)?nèi)參基因穩(wěn)定性計算orm 程序的功能之一是利用各基因下在各樣本所表達(dá)的 Ct 值，進(jìn)行命令得出穩(wěn)定均值 M，且 M 值與基因的穩(wěn)定性形成負(fù)向規(guī)律。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S436.64

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 郝興宇;張金桐;王瑞;曹天文;;核桃舉肢蛾性信息素通訊系統(tǒng)掃描電鏡觀察[J];山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2005年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 徐軍;甜菜夜蛾滯育激素—性信息素合成激活肽基因（DH-PBAN）和促前胸腺激素（PTTH）基因的克隆和表達(dá)分析[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2007年

本文編號：2648124