【摘要】：背景與目的:短腸綜合征(short bowel syndrome,SBS)是指大部分小腸由于物理或功能性損失,致使小腸有效吸收面積過少進(jìn)而出現(xiàn)的營(yíng)養(yǎng)不良綜合征。臨床上以腹瀉、水電解質(zhì)紊亂、吸收障礙和進(jìn)行性營(yíng)養(yǎng)不良為主要特點(diǎn)。通常,當(dāng)殘余腸道長(zhǎng)度≤35cm時(shí)可以定義為超短腸綜合征(ultra short bowel syndrome,USBS)。當(dāng)前,臨床上對(duì)于SBS的治療以非手術(shù)治療為主,而其中主要依靠于腸外營(yíng)養(yǎng)(Parenteral nutrition,PN)為SBS患者提供額外的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充,維持生理代謝需求。但PN同時(shí)也是一種高風(fēng)險(xiǎn)、昂貴和存在眾多潛在不足的治療方法。例如PN相關(guān)的導(dǎo)管性感染、腸粘膜萎縮、肝衰竭等,這些嚴(yán)重威脅了SBS患者的生命。尤其是對(duì)于USBS患者,由于剩余小腸極短或完全喪失小腸,終生需要依賴于PN并遭受上述風(fēng)險(xiǎn)的打擊。所以,尋找一種安全、有效的方法促使此類患者殘余結(jié)腸功能的代償,使其減少對(duì)PN的使用或者擺脫對(duì)PN的依賴,是對(duì)USBS患者治療的一種新思路。我們課題組前期研究通過構(gòu)建USBS大鼠模型已經(jīng)證實(shí)剩余結(jié)腸不論是在形態(tài)還是在功能上都可以發(fā)生代償變化,并發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3(Protein disulfide isomerase A3,PDIA3)顯著高表達(dá)于代償?shù)慕Y(jié)腸組織中。PDIA3作為ER常駐氧化還原伴侶,研究已經(jīng)證實(shí)其參與著眾多關(guān)乎細(xì)胞生存的信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控環(huán)節(jié),對(duì)細(xì)胞具有潛在促增殖的作用。那么,PDIA3在USBS結(jié)腸代償中是否也作為關(guān)鍵調(diào)控蛋白而發(fā)揮著促結(jié)腸代償?shù)淖饔媚?我們既往的研究通過上調(diào)和下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞(SW480)中PDIA3的表達(dá),發(fā)現(xiàn)PDIA3對(duì)SW480細(xì)胞具有促進(jìn)增殖和抑制凋亡的作用。那么,PDIA3在人正常結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞中是否也具有同樣的作用呢?本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建過表達(dá)和沉默質(zhì)粒,雙向調(diào)控PDIA3在人正常結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞(NCM460)中的表達(dá)量,觀察其對(duì)NCM460細(xì)胞是否同樣能產(chǎn)生促進(jìn)增殖并抑制凋亡的作用。為進(jìn)一步研究PDIA3在結(jié)腸代償中是否作為關(guān)鍵蛋白而發(fā)揮作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.構(gòu)建真核細(xì)胞過表達(dá)質(zhì)粒(PDIA3-GV141)和沉默質(zhì)粒(PDIA3-shRNA),使用DNA測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建的成功與否;2.培養(yǎng)NCM460細(xì)胞系,使用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)將過表達(dá)質(zhì)粒及沉默質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染NCM460細(xì)胞;3.Western blotting方法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同劑量過表達(dá)和沉默質(zhì)粒后細(xì)胞PDIA3蛋白表達(dá)量的變化情況;4.CCK-8法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同劑量過表達(dá)和沉默質(zhì)粒后24h、48h、72h的細(xì)胞增殖率;5.流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同劑量過表達(dá)和沉默質(zhì)粒后細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果:1.DNA測(cè)序驗(yàn)證成功合成真核細(xì)胞過表達(dá)質(zhì)粒(PDIA3-GV141)和沉默質(zhì)粒(PDIA3-shRNA)。2.Western blotting條帶提示:過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組NCM460細(xì)胞PDIA3的表達(dá)量高于空載體組,且與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的劑量呈正相關(guān);沉默實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組NCM460細(xì)胞PDIA3的表達(dá)量低于空載體組,且與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的劑量呈負(fù)相關(guān)。3.CCK-8示:過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組在24h、48h、72h增殖率均低于空載體組(P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義);沉默實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組在24h、48h、72h增殖率均高于空載體組(P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。4.流式結(jié)果示:過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率均高于空載體組(P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義);沉默實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率均低于空載體組(P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。結(jié)論:PDIA3抑制人結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞(NCM460)的增殖,促進(jìn)其凋亡。
【圖文】：

圖 1-2 USBS 及正常大鼠結(jié)腸粘膜在光鏡和電鏡下的改變[34][36]Fig 1-2 Change in colonic mucosal under optical and electron microscope of USBSand normal rats[34][36]功能上：主要表現(xiàn)為對(duì)水分、氨基酸及木糖醇等營(yíng)養(yǎng)素的吸收增加[33][37]。而在臨床上，直接證據(jù)則是：USBS 患者經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間代償后，逐步減少 PN 的使用或者擺脫對(duì) PN 的依賴性。不僅如此，由于結(jié)腸存在“結(jié)腸消化”作用[38]，例如纖維素?zé)o法在小腸被吸收，但進(jìn)入結(jié)腸內(nèi)能被菌群酵解并生成 SCFA，可為機(jī)體帶來 4.2 mJ / d 額外的能量吸收[28]，是廣泛腸切除后患者能量來源的重要保障。為此，ESPEN 相關(guān)指南[39]甚至認(rèn)為保留大部分結(jié)腸，在能量的吸收上相當(dāng)于保留了至少 50cm 的小腸。而功能上的另一代償作用則表現(xiàn)在腸內(nèi)容物運(yùn)輸減慢，延長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物在腸腔內(nèi)的停留時(shí)間進(jìn)而使其吸收增加[40-41]。SCFA 不僅能直接為結(jié)腸粘膜細(xì)胞提供代謝底物，促進(jìn)其生長(zhǎng)和代償，相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)其可能參與神經(jīng)

圖 1-3 PDIA3 的分子結(jié)構(gòu)Fig 1-3 The molecular structure of PDIA3.3.2. PDIA3 的生物學(xué)功能ER 中：PDIA3 在 ER 中通常被視為常駐氧化還原伴侶。其通過與鈣網(wǎng)蛋白鈣聯(lián)蛋白（CRT 和 CNX）的 P 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，，介導(dǎo)蛋白質(zhì)的折疊作用[73]。CRT /NX 通過特異性結(jié)合錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)并阻止它們從 ER 分泌而協(xié)助蛋白質(zhì)合的質(zhì)量控制；最近研究表明，PDIA3 在蛋白質(zhì)折疊中的生理功能作用可以被劫，以促進(jìn)病毒在某些條件下的感染：PDAI3 異構(gòu)化 SV40 病毒衣殼蛋白（病毒初始脫殼組成部分）的二硫鍵[74]。細(xì)胞膜上：PDIA3 的巰基-二硫鍵交換能力還通過建立分子間和分子內(nèi)的二鍵在膜位點(diǎn)發(fā)揮著重要的作用。PDIA3 在配子成熟過程中上調(diào)，是精子和卵子
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R574

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本文編號(hào)：2647402