【摘要】：四乙基氯化銨(TEA)作為大電導(dǎo)激活的鉀離子通道的阻斷劑,它能夠誘發(fā)小鼠氣管環(huán)震顫,但是TEA誘導(dǎo)的小鼠平滑肌細(xì)胞震顫產(chǎn)生的分子機制以及調(diào)控平滑肌功能的作用上存在很大的爭議。本論文以離體小鼠主氣管環(huán)和單個氣道平滑肌細(xì)胞為標(biāo)本,借助生物機能實驗系統(tǒng)(BL-420S)以及激光共聚焦顯微器(LSM700),研究了鉀離子通道阻斷劑(TEA)、L-型電壓依賴鈣通道阻斷劑(硝苯地平)、氯離子通道阻斷劑(NA,尼弗酸)、膽堿能受體激動劑(ACh,乙酰膽堿)、三磷酸肌醇受體阻斷劑(2-APB,2-氨基乙酯二苯基硼酸)、肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵抑制劑(TG,毒胡蘿卜素)、電壓依賴性鈉離子通道阻斷劑(TTX,河豚毒素)、蘭尼堿受體阻斷劑(蘭尼堿)、鈉鈣交換泵抑制劑(KB-R7943)在平滑肌周期性震顫中發(fā)揮的作用。結(jié)果顯示TEA引發(fā)了氣道震顫,震顫能夠被硝苯地平、河豚毒素、尼弗酸、KB-R7943抑制,將細(xì)胞外液中的鈉離子用鋰離子替代,使鈉鈣交換體失活,震顫先增強后消失。這些結(jié)果表明L-型鈣離子通道、電壓依賴性鈉離子通道、鈣激活氯離子通道通道、鈉鈣交換體參與了震顫的發(fā)生。在單個小鼠氣道平滑肌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),TEA引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子振蕩,接著文章對細(xì)胞內(nèi)鈣庫進行了研究,發(fā)現(xiàn)在毒胡蘿卜素、2-氨基乙酯二苯基硼酸存在的情況下,TEA未能引發(fā)震顫,但是蘭尼堿存在的情況下,TEA能夠引發(fā)震顫,將細(xì)胞外鈣離子移除,也能夠抑制震顫,這表明三磷酸肌醇受體介導(dǎo)的鈣離子的釋放和鈣庫排空激活的通道介導(dǎo)的細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流參與了離體小鼠氣管環(huán)的震顫。所有數(shù)據(jù)表明,TEA引起的震顫是L-型鈣通道、電壓依賴性鈉離子通道、鈣離子激活的氯離子通道、鈉鈣交換體、三磷酸肌醇受體介導(dǎo)的鈣離子釋放和細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流協(xié)同調(diào)控的結(jié)果。此外,文章第二部分進行了哮喘相關(guān)基因敲除小鼠模型的建立工作。以TMEM16A基因為編輯對象,根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)設(shè)計原理,設(shè)計終篩選得到兩條sgRNA。通過顯微注射法,將sgRNA和Cas9mRNA注射到受精卵胞漿,最終得到五只F0代小鼠鼠尾基因組鑒定結(jié)果顯示兩只小鼠完成基因編輯。
【圖文】：

第四章 離體氣管環(huán)震顫的引發(fā)4.1 前言TEA 作為鉀離子通路的阻斷劑，，能夠阻斷細(xì)胞膜上的鉀離子通道，引起細(xì)胞膜輕微去極化。根據(jù)之前研究，TEA 能夠刺激平滑肌細(xì)胞，誘發(fā)平滑肌震顫。本實驗中，首先在小鼠離體氣管環(huán)靜息狀態(tài)下，給予濃度梯度（1、10、20、30 mM）的 TEA 刺激，在濃度為 20 mM 時 TEA 誘發(fā)了明顯的震顫(圖 4.1A)。由于哮喘患者氣管環(huán)處于收縮狀態(tài)，利用低濃度的 ACh(1μM)對離體氣管環(huán)進行預(yù)收縮處理，我們發(fā)現(xiàn)，TEA 同樣誘發(fā)了離體氣管環(huán)的震顫，(圖 4.1B)。

圖 5.1 VNa和 LVDCCs 在 TEA 誘導(dǎo)的小鼠氣管環(huán)震顫中的作用 TEA 誘導(dǎo)的小鼠氣管環(huán)震顫LVDCCs 阻斷劑 nifedipine (A)和 VNa通道阻斷劑 TTX (B)阻斷。5.3 NCX 和 CaCCs 在 TEA 誘導(dǎo)氣管環(huán)震顫中的作用細(xì)胞膜上 LVDCCs 通道的激活使鈣離子從細(xì)胞外流入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致了胞內(nèi)鈣離子升高，胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的升高引起鈣離子激活的通道的激活。因為 T阻斷了鈣離子激活的鉀離子通路，所以我們猜測，CaCCs 鈣激活的氯離子通道與了 TEA 誘導(dǎo)氣管環(huán)震顫。在實驗中利用梯度濃度的 NA（尼弗酸）阻斷 CaCC結(jié)果顯示 31.6 μM 的 NA 阻斷了 TEA 誘導(dǎo)氣管環(huán)震顫(圖 5.2，n=6)。同時細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，也將會激活鈉離子鉀離子交換體 NCX，本實驗中細(xì)胞外液的鈉離子用鋰離子替代，使 NCX 失活，TEA 誘發(fā)的震顫瞬時增強之消失 (圖 5.3A，n=6)。而且，震顫也能夠被 NCX 的選擇性阻斷劑 KB-R7943除 (圖 5.3B，n=6)。這些結(jié)果顯示，NCX 也參與了小鼠離體氣管環(huán)的震顫。
【學(xué)位授予單位】：中南民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R562.25

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本文編號：2647191