【摘要】：研究背景:肺癌是常見的惡性腫瘤之一,近年高居癌癥所致的死亡原因首位,嚴重危害人類健康,對世界范圍公共衛(wèi)生慢性非傳染性疾病防治發(fā)起了嚴峻的挑戰(zhàn)。根據(jù)最新版的《美國癌癥統(tǒng)計》,在2018年,美國預計有二十三萬人發(fā)病,并預估有十五萬人將死于肺癌。在世界范圍內,每年有一百八十萬人被診斷為肺癌,并導致一百六十萬人死亡。在我國,根據(jù)2015年發(fā)布的中國癌癥統(tǒng)計年報顯示,2015年全國預計新發(fā)肺癌病例數(shù)為73.3萬人,占新發(fā)腫瘤的17%,而預計肺癌致死人數(shù)將達到61.0萬人,占腫瘤死因人數(shù)的21.7%。由于診斷上的困難以及治療策略局限,不同地區(qū)和國家肺癌病人五年生存率在4-17%之間,仍處于較低水平。因此,尋找有價值的肺癌診斷的分子生物標志物及潛在的基因治療靶點是近來肺癌領域的研究重點,探索影響肺癌發(fā)生發(fā)展的基因表達及其分子功能及機制是肺癌研究的當務之急。近年來,一些在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要調控作用的新型分子被逐漸發(fā)現(xiàn)。長鏈非編碼RNA是一種長度超過兩百個核苷酸,缺乏蛋白編碼能力的RNA轉錄本。長鏈非編碼RNA在表觀遺傳水平、轉錄水平、轉錄后水平均可發(fā)揮重要的調控作用,參與多種重要的生物學功能。長鏈非編碼RNA按基因定位大致可分為:正義鏈長鏈非編碼RNA(Sense lncRNAs)、反義鏈長鏈非編碼RNA(Antisense lncRNAs)、雙向長鏈非編碼RNA(Bidirectional lncRNAs)、基因間長鏈非編碼RNA(Intergenic lncRNAs)及基因內長鏈非編碼RNA(Intronic lncRNAs)。反義長鏈非編碼RNA是長鏈非編碼RNA的一種,其同時也屬于天然反義轉錄本(Natural antisense transcripts)的一種亞類,在哺乳動物中含量豐富,有多樣的生物功能調節(jié)機制,并以此來發(fā)揮廣泛的生物學功能。研究顯示,反義長鏈非編碼RNA常富集于編碼基因的起始端或者末尾端,主要用其與編碼基因天然配對的反義鏈或其他機制調控臨近或者遠端的編碼基因表達。在腫瘤生物學中,反義長鏈非編碼RNA的突變或異常表達與肺癌進展相關,如上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition)、腫瘤增殖、侵襲及遠端轉移等。與此同時,許多癌癥相關的反義長鏈非編碼RNA被逐漸發(fā)現(xiàn),例如HOX反義RNA(HOTAIR)、肌動蛋白絲相關蛋白1反義RNA1(AFAP1-AS1)、FEZ家族鋅指蛋白1反義RNA1(FEZF1-AS1)等。因此,近來的研究已表明反義長鏈非編碼RNA對腫瘤調控具有重要意義,然而,目前研究對反義長鏈非編碼RNA在肺癌中的表達情況及其如何調控肺癌的發(fā)生發(fā)展的細胞功能和分子機制還有待進一步探索。課題組前期發(fā)現(xiàn)多篇文獻報道染色體2q12-13區(qū)段內等位基因缺失、單核苷酸多態(tài)性等與多種腫瘤及疾病相關,此區(qū)段內含有包括NPHP1、LIMS3、LIMS1、SEPT10、Linc0016等10個基因,我們通過小樣本實驗發(fā)現(xiàn)位于染色體2q12.3的反義長鏈非編碼RNA POSH2-AS1(Plenty of SH3 domin family 2 antisense RNA1)在肺癌組織中呈低表達。在基因位置上,POSH2-AS1與含有多個Src同源3結構域(Src homolog 3 domain,SH3 domain)編碼基因POSH2(Plenty of SH3domin family 2,POSH2)的上游核心啟動子區(qū)及其第一個外顯子堿基序列反向天然互補配對。因此,課題組擬假設反義長鏈非編碼RNA POSH2-AS1與肺癌發(fā)生發(fā)展相關,并擬通過擴大樣本量檢驗POSH2-AS1在肺癌中的表達情況,構建POSH2-AS1高表達和低表達細胞模型,研究其腫瘤細胞生物學功能,通過生物信息學分析POSH2-AS1其潛在調控靶基因,探索其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的功能及可能的作用機制,為肺癌的診斷和治療提供科學依據(jù)。目的:探討反義長鏈非編碼RNA POSH2-AS1在肺癌中的表達模式、腫瘤生物學功能及機制。方法:1.在課題收集的共209例新診斷的華南及華東肺癌病例肺癌組織及癌旁正常肺組織樣本中檢測POSH2-AS1表達水平,并分析其在肺癌中的表達情況與肺癌病例臨床特征的關系。2.構建POSH2-AS1高表達和低表達人肺癌細胞系A549及PC-9模型以及相應的對照模型;采用CCK-8實驗研究POSH2-AS1高表達、低表達對肺癌細胞系的增殖能力影響;采用平板克隆實驗研究POSH2-AS1高表達、低表達對肺癌細胞的增殖能力和群體依賴性的影響;采用流式細胞儀研究POSH2-AS1高表達、低表達對肺癌細胞的周期和凋亡的影響;采用細胞遷移及侵襲實驗研究POSH2-AS1高表達、低表達對肺癌細胞的遷移能力和侵襲能力的影響;采用裸鼠成瘤實驗研究POSH2-AS1高表達、低表達對肺癌細胞體內成增殖成瘤能力的影響;采用腫瘤細胞裸鼠尾靜脈注射實驗研究POSH2-AS1高表達、低表達對肺癌細胞的體內轉移能力的影響。3.在課題收集的肺癌組織及癌旁正常組織樣本中檢測POSH2-AS1潛在靶基因的表達水平,并研究其與POSH2-AS1的關系;利用構建的POSH2-AS1高表達、低表達肺癌細胞系模型研究POSH2-AS1的表達變化對潛在靶基因表達的影響;采用熒光素酶報告基因研究POSH2-AS1對靶基因表達的直接調控機制;構建的POSH2-AS1高表達、低表達肺癌細胞系模型中,采用siRNA敲低靶基因表達,進一步研究其調控機制。結果:1.通過q-RT PCR檢測POSH2-AS1表達水平,結果顯示,與癌旁正常肺組織相比,POSH2-AS1在肺癌組織中呈低表達(P=0.004)。2.POSH2-AS1低表達與肺癌臨床分期(I+II vs.III+IV,P=0.003)、原發(fā)灶大小(T1+T2 vs.T3+T4,P=0.001)存在關聯(lián)。3.在POSH2-AS1高表達和低表達A549及PC-9肺癌細胞系模型中進行CCK-8細胞增殖實驗顯示,在兩組細胞系中,POSH2-AS1高表達組的細胞生長速率低于對照組(P0.01),而低表達組的細胞生長速率高于對照組(P0.01)。4.在POSH2-AS1高表達和低表達A549及PC-9肺癌細胞系模型中進行平板克隆實驗顯示,POSH2-AS1高表達組細胞集落形成率低于對照組(P0.01),而低表達組細胞集落形成率高于對照組(P0.01)。5.在POSH2-AS1高表達和低表達A549肺癌細胞系模型中進行細胞周期檢測顯示,POSH2-AS1高表達組與其對照組相比,休眠期及分裂前期(G0-G1期)細胞數(shù)量增多(P0.01),DNA合成期(S期)細胞數(shù)量減少(P0.05),低表達組與其對照組相比,休眠期及分裂前期(G0-G1期)細胞數(shù)量減少(P0.01),DNA合成期(S期)細胞數(shù)量增多(P0.05);在PC-9肺癌細胞系中,POSH2-AS1高表達組與其對照組相比,休眠期及分裂前期(G0-G1期)細胞數(shù)量增多(P0.01),DNA合成后期及分裂期(G2-M期)細胞數(shù)量減少(P0.01),低表達組休眠期及分裂前期(G0-G1期)細胞數(shù)量減少(P0.01),DNA合成期(S期)細胞數(shù)量增多(P0.01),DNA合成后期及分裂期(G2-M期)細胞數(shù)量增多(P0.01)。在POSH2-AS1高表達和低表達A549肺癌細胞系模型中進行細胞凋亡檢測顯示,與其對照組相比,POSH2-AS1高表達組細胞凋亡率增加(P0.01),低表達組細胞凋亡率減少(P0.01)。6.在POSH2-AS1高表達和低表達A549及PC-9肺癌細胞系模型中進行細胞自噬水平檢測,結果發(fā)現(xiàn),POSH2-AS1對自噬的影響不顯著。7.在POSH2-AS1高表達和低表達A549及PC-9肺癌細胞系模型中進行細胞遷移及侵襲實驗顯示,POSH2-AS1高表達組穿過小室的細胞數(shù)量低于對照組(P0.01),低表達組穿過小室的細胞數(shù)量高于對照組(P0.01)。8.裸鼠成瘤實驗顯示,與對照組相比,POSH2-AS1高表達組肺癌細胞在裸鼠體內生長能力降低(P0.01),低表達組肺癌細胞裸鼠體內生長能力增加(P0.01);裸鼠尾靜脈注射肺轉移實驗顯示,與對照組相比,POSH2-AS1高表達組細胞肺轉移能力降低(P0.01),低表達組細胞肺轉移能力增加(P0.01)。9.通過生物信息學分析顯示,POSH2-AS1與POSH2存在天然堿基互補配對序列,POSH2-AS1與POSH2上游2214bp及POSH2第一個外顯子578bp的堿基互補配對。通過分析POSH2-AS1和POSH2的基因表達情況發(fā)現(xiàn),POSH2-AS1表達水平與POSH2表達水平呈正相關(肺癌組織r=0.374,P0.01;癌旁正常組織r=0.393,P0.01)。10.通過q-RT PCR檢測與蛋白編碼基因POSH2的表達水平,結果表明POSH2在肺癌組織中呈低表達(P0.05),其低表達與肺癌臨床分期(I+II vs.III+IV,P0.01)、原發(fā)灶大小(T1+T2 vs.T3+T4,P0.01)、淋巴結轉移(N0 vs.N1+N2+N3,P0.01)、遠處轉移(M0 vs.M1,P0.01)相關。11.對POSH2-AS1及POSH2在基因表達水平的研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,高表達POSH2-AS1能夠增加POSH2表達量(P0.01),而低表達POSH2-AS1能夠降低POSH2表達量(P0.01)。12.通過對POSH2啟動子熒光素酶報告基因載體分析POSH2-AS1對POSH2啟動子活性影響,結果顯示POSH2-AS1高表達能增加POSH2啟動子活性(P0.05),低表達POSH2-AS1能夠降低POSH2啟動子活性(P0.01)。13.在POSH2-AS1高表達及低表達細胞模型中,進一步采用siRNA對POSH2-AS1的潛在靶基因POSH2進行敲低實驗,觀察其對細胞增殖及凋亡,結果顯示,在敲低了POSH2表達后,POSH2-AS1高表達組的細胞生長速率高于對照組(P0.01),細胞凋亡率低于對照組(P0.01),而未敲低POSH2的高表達POSH2-AS1組細胞生長速率低于對照組(P0.01),細胞凋亡率高于對照組(P0.01)。對低表達POSH2-AS1進行敲低POSH2后,結果顯示,既POSH2-AS1低表達又敲低POSH2組與不敲低POSH2只低表達POSH2-AS1組相比,細胞增殖、凋亡沒有顯著差異(P0.05),但其細胞增殖都高于對照組(P0.01),細胞凋亡率低于對照組(P0.01)14.通過對JNK通路核內轉錄反應元件質粒載體探究POSH2-AS1是否影響SPAK/JNK通路活化,結果顯示,高表達POSH2-AS1可增加SPAK/JNK通路活性(P0.01),而低表達POSH2-AS1未明顯降低SPAK/JNK通路活性(P0.05),但在饑餓處理細胞后,低表達POSH2-AS1表現(xiàn)出對SPAK/JNK通路活化的抵抗(P0.01)。結論:1.POSH2-AS1在肺癌組織中呈低表達,其低表達與肺癌臨床進展相關。2.POSH2-AS1能夠抑制肺癌細胞增殖、轉移及侵襲,促進細胞凋亡,并在裸鼠體內可抑制肺癌細胞成瘤能力及肺轉移能力。3.POSH2-AS1可正向調控靶基因POSH2及影響SPAK/JNK通路活化,從而參與肺癌細胞的生物學進程。本研究的創(chuàng)新之處:研究首次報道了反義長鏈非編碼RNA POSH2-AS1在肺癌中的表達模式及與臨床特征關系,通過一系列細胞功能實驗探索其腫瘤生物學功能,并研究了其可能的調控機制。本研究的不足之處:需要進一步研究POSH2-AS1對其靶基因POSH2的直接調控機制及其參與肺癌發(fā)生發(fā)展的具體作用機制。此外,反義長鏈非編碼RNA POSH2-AS1對可能的遠端調控基因的研究暫未探索。研究總結:反義長鏈非編碼RNA POSH2-AS1在肺癌組織中呈現(xiàn)低表達,其低表達與肺癌臨床特征相關,并通過調控編碼基因POSH2及影響SPAK/JNK通路發(fā)揮腫瘤細胞生物學功能。該研究提示反義長鏈非編碼RNA POSH2-AS1可作為肺癌診斷的生物標志物及潛在的治療靶點。
【圖文】：

遠處轉移無 (M0) 84 (67.7) 55 (64.7) 0.209 0.648有 (M1) 40 (32.3) 30 (35.3)組織類型腺癌 53 (42.8) 37 (43.5) 0.150 0.928鱗癌 36 (29.0) 26 (30.6)其它 35 (28.2) 25 (25.9)經統(tǒng)計學檢驗，所研究的肺癌病例各臨床特征在兩中心分布無統(tǒng)計學差異。3.2 POSH2-AS1 在肺癌組織中的表達分布本研究通過 q-RT PCR 檢測 POSH2-AS1 在兩中心 209 對肺癌及癌旁正常肺組織中的表達情況。結果如圖 3-1 所示，在華南肺癌病例人群中，POSH2-AS1 在癌組織中的表達水平低于癌旁正常組織的占 66.9% (83/124)，POSH2-AS1 在癌組織中的表達水平高于癌旁正常組織的占 33.1% (41/124)，與癌旁正常組織相比，POSH2-AS1 在肺癌中呈現(xiàn)低表達 (P=0.041)；在華東肺癌病例人群中，POSH2-AS1 在癌組織中的表達水平低于癌旁正常組織的占 61.2% (52/85)，POSH2-AS1 在癌組織中的表達水平高于癌旁正常組織的占 38.8% (33/85)，與癌旁正常組織相比，POSH2-AS1 在肺癌組織中呈現(xiàn)低表達 (P=0.045)。

圖 3-2 POSH2-AS1 在總樣本中的表達水平SH2-AS1 表達水平與肺癌病例臨床特征及進展的關系究進一步分析 POSH2-AS1 的表達水平與肺癌病例臨床特征的關系，發(fā)現(xiàn)在華南病例人群中，臨床分期 1 期及 2 期早期肺癌病例，-AS1 病例占 44.0% (22/50)，低表達 POSH2-AS1 病例占 56% (28/5 3 期及 4 期的晚期肺癌病例中，高表達 POSH2-AS1 病例占 25.7%達病例占 74.3% (55/74)。經單因素及校正年齡、性別的分層分析-AS1 低表達與臨床分期相關 (粗 P=0.035; 校正 P=0.036)。在原發(fā) 及 T2 期病例高表達 POSH2-AS1 占 43.5% (30/69)，低表達 POSH.5% (39/69)；在T3期及T4期肺癌病例中，高表達POSH2-AS1病例，而低表達病例占 80.0% (44/55)。經單因素及校正年齡、性別的分POSH2-AS1 低表達與原發(fā)灶大小相關 (粗 P=0.007; 校正 P=0.007華東病例人群中，臨床分期1期及2期早期肺癌病例中，高表達PO 55.2% (16/29)，低表達 POSH2-AS1 病例占 44.8% (13/29)；在臨
【學位授予單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2

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1 曹翼;反義長鏈非編碼RNA POSH2-AS1調控編碼基因POSH2在肺癌中的作用及機制研究[D];廣州醫(yī)科大學;2018年

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本文編號：2645628