發(fā)布時間：2020-04-30 06:43

【摘要】：中國水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)是我國十大傳統(tǒng)名花,觀賞價值較高。然而水仙花色單調(diào)、品種單一,至今中國水仙品種仍較少。深入研究中國水仙花色形成的分子機制,進行分子改造,將是中國水仙花色創(chuàng)新和新品種培育的有效途徑。本研究以漳州水仙為材料,通過水仙花瓣和副冠轉(zhuǎn)錄組測序分析,篩選出參與調(diào)控類黃酮合成途徑的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子,進行表達分析及功能驗證,為中國水仙花色形成機理的研究提供理論基礎。本研究主要獲得以下研究成果:1.本試驗以漳州水仙'金盞銀臺'為實驗材料,提取始花期花朵(花瓣和副冠混合)RNA,用IlluminaHiseq 2000進行高通量測序,共獲得 23,081,029 條total clean reads,組裝后共獲得 55,418 條 unigene,其中超過500的unigene有21,750個,長度在1kb以上的unigene有11,053 條,unigene 平均讀長 669bp,N50 讀長 1,049bp。對 Unigene進行功能注釋,包括與 NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫的比對,共獲得32,414條Unigene的注釋結果,從而構建了水仙花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。進行基于Unigene庫的基因結構分析,其中SSR分析共獲得3,276個SSR標記。將花轉(zhuǎn)錄組與之前測序的鱗莖盤轉(zhuǎn)錄組進行分析,共得到7,059個差異表達基因(DEGs),其中3,663個DEGs上調(diào)表達,3,396個DEGs下調(diào)表達,差異表達基因被注釋到126個KEGG代謝通路。2.通過花轉(zhuǎn)錄組與鱗莖盤轉(zhuǎn)錄組差異表達基因分析,獲得2個與類黃酮代謝相關的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。初步序列分析表明其中一個與花青素合成抑制有關,命名為NtMYB7;另一個與類黃酮合成激活有關,命名為NtMYB8。3.從漳州水仙中克隆出NtMYB7和NtMYB8編碼區(qū)全長序列,開放閱讀框(ORF)分別為753bp、803bp,分別編碼250和268個氨基酸。NtMYB7和NtMYB8的GenBank登錄號為MF522208和MF522209。蛋白多重序列比對分析發(fā)現(xiàn)NtMYB7、NtMYB8基因都含有R2和R3保守結構域,屬于R2R3-MYB基因;系統(tǒng)進化樹分析結果顯示NtMYB7與花青素合成抑制因子聚為一類,NtMYB8與花青素合成激活因子聚為一類。通過對NtMYB7、NtMYB8在中國水仙不同花期花瓣和副冠以及不同器官的表達,發(fā)現(xiàn)NtMYB7表達量在鱗莖盤中表達量最高,表達量是花苞期花瓣表達量的近20倍;在花瓣中,NtMYB7基因的相對表達量隨著水仙花的開放逐漸升高,盛花期達到最高;在副冠中,始花期表達量最高,花苞期和盛花期表達量較低。NtMYB8在花中的表達量高于鱗莖盤和葉片,花苞期副冠中NtMYB8的表達量是鱗莖盤的近17倍,隨著花的開放,NtMYB8在副冠中的表達量顯著下降。4.構建 pSAK277-NtMYB7 和 pSAK277-NtMYB8 植物表達載體,并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,進行煙草瞬時表達實驗。在煙草瞬時表達中,定量PCR分析表明NtMYB7顯著抑制煙草黃酮醇代謝分支FLS基因的表達,同時抑制StMYB激活的花青素和原花青素合成結構基因的表達。研究結果初步判斷NtMYB7是中國水仙類黃酮代謝途徑的抑制因子。單獨注射NtMYB8基因煙草葉片沒有變化,NtMYB8基因與StBHLH混合注射,定量結果顯著上調(diào)FLS、LAR和ANS基因的表達,NtMYB8可能與StBHLH結合促進黃酮醇、原花青素以及花青素的合成。但是NtMYB8在水仙的花中表達量最高,所以推測它在中國水仙中,特別是副冠中可能同時激活黃酮醇、原花青素和花青素的合成,但是由于水仙與煙草不同,在水仙中是否激活黃酮醇代謝途徑,還有待進一步驗證。5.通過NtMYB7基因、NtMYB8基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化煙草,獲得了轉(zhuǎn)基因植株,煙草開花表型分析發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因花色顏色變淺,進一步推測NtMYB7基因可能抑制了花青素代謝途徑,導致顏色變淺;NtMYB8基因可能主要促進黃酮醇分支,從而與花青素分支競爭,導致煙草花色變淺,其基因功能需要后續(xù)實驗進一步驗證。
【圖文】：

（４）鞋酐（Ｐｈｌｏｂａｐｈｅｎｅｓ）途徑；（５）原花青素（Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙｎｉｄｉｎｓ）途徑；（６）花逡逑青素（Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）途徑；（７）橙酮（Ａｕｒｏｎｅｓ）途徑［１７］。逡逑類黃酮合成途徑如圖１－１，類黃酮色素的前體物質(zhì)是苯丙氨（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ），逡逑其合成途徑由多種結構基因和調(diào)節(jié)基因控制。首先，類黃酮代謝途徑為由苯丙氨逡逑酸裂解酶（ＰＡＯ催化苯丙氨酸形成肉桂酸，再經(jīng)肉桂酸徑化酶（Ｃ份）和香豆逡逑酞ＣｏＡ連接酶ＵＣＺ）的催化作用形成４－香豆素－ＣｏＡ，接著在查兒酮合成酶逡逑Ｃ／對（Ｃｈａｌｃｏｎｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ）的作用下生成查兒酮；其中香豆酰ＣｏＡ來源于苯丙煉逡逑途徑（Ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ邋ｐａｔｈｗａｙ），丙二酰ＣｏＡ來自乙憸ＣｏＡ［１８］；接著，以查爾逡逑酮為底物并在查耳酮異構酶Ｃ７／／（Ｃｈａｌｃｏｎｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ）的作用下生成黃酮；之后黃逡逑酮在黃酮醇－３－輕化酶（Ｆａｖｏｎｏ３－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ邋）和黃酮醇－３’－輕化酶逡逑’／／（Ｆｌａｖｏｎｏｌ邋３’－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）的作用下形成二氫黃酮醇，在二氫黃酮醇４－還原酶逡逑ｉ＾Ｐ＾Ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌ邋４－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ邋）和黃酮醇合成酶邋ＦＬＳ（Ｆｌａｖｏｎｏｌ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ）作用下逡逑生二氫黃酮醇分別生成花青素和黃酮醇；原花青素原花青素還原酶逡逑Ｕｉ？（Ｌｅｕｃｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ邋ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）的催化作用下生成兒茶素，花青素在花青素還逡逑原酶邐Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ邋ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）催化下形成表兒茶素［

。分析，我們能在宏觀水平上檢測物種轉(zhuǎn)錄本的結構和表達量。本部分實驗主要以逡逑水仙始花期的花朵為實驗材料，基于Ｉｌｌｕｍｉｎａ邋ＨｉＳｅｑＴＭ邋２０００進行轉(zhuǎn)錄組高通量逡逑測序。前期研究發(fā)現(xiàn)，中國水仙花中黃酮類物質(zhì)主要是黃酮醇，淲莖盤中主要黃逡逑酮類物質(zhì)是原花青素％因此本研宄將花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與前期獲得的淲莖盤轉(zhuǎn)錄組逡逑數(shù)據(jù)對比分析，，篩選出類黃酮合成途徑參與調(diào)控結構基因的相關轉(zhuǎn)錄因子，逡逑為進一步分析水仙類黃酮代謝途徑的調(diào)控機制和中國水仙花色研究奠定基礎。逡逑１實驗材料逡逑１．１植物材料逡逑以漳州水仙‘金盞銀臺’（白色花瓣和黃色副冠）為實驗材料，水仙的成花過逡逑程分為３個時期，轉(zhuǎn)錄測序以水仙始花期的花朵為實驗材料。取水仙種球，剝?nèi)ュ义献钔鈱喻[片，放入水中培養(yǎng)至開花后，取始花期的花瓣和副冠（去掉花絲、花藥逡逑和花柱）混合后置于離心管中，用液氮速凍，立即放入－８０°Ｃ冰箱中貯存?zhèn)溆�。逡�?
【學位授予單位】：福建農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2;S682.21

【參考文獻】

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6 李錫花;吳Z

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