【摘要】：貝殼基質(zhì)蛋白(Shell Matrix Proteins,SMPs)是貝殼形成的主要參與者和功能執(zhí)行者,在有機(jī)框架構(gòu)建和礦物沉積過發(fā)揮重要作用。本課題組前期通過對(duì)馬氏珠母貝(Pinctada fucata martensii)貝殼基質(zhì)蛋白質(zhì)組分析,獲得了棱柱層SMPs。本研究對(duì)其中的5個(gè)SMPs基因進(jìn)行全長(zhǎng)克隆,并通過q RT-PCR、原位雜交(ISH)、RNAi和原核表達(dá)技術(shù)進(jìn)行功能驗(yàn)證。結(jié)果如下:1、β-N-乙酰-己糖胺酶(Beta-hexosaminidase/Beta-N-acetylhexosaminidase,HEX)屬于糖苷水解酶20家族(GH20),是幾丁質(zhì)代謝的關(guān)鍵水解酶。幾丁質(zhì)作為有機(jī)框架主要成分,其代謝在貝殼礦化中發(fā)揮重要作用。本研究克隆獲得2個(gè)β-N-乙酰-己糖胺酶基因Pm HEX和Pm HEXL。Pm HEX全長(zhǎng)3 813 bp,編碼1 141個(gè)氨基酸;Pm HEXL全長(zhǎng)2 760bp,編碼774個(gè)氨基酸;二者均含有兩個(gè)典型的GH20和GH20b結(jié)構(gòu)域和一個(gè)碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CHB-HEX)。QRT-PCR分析表明Pm HEX和Pm HEXL在外套膜邊緣區(qū)(ME)和套膜區(qū)(MP)均顯著高表達(dá),ISH檢測(cè)顯示Pm HEX和Pm HEXL均主要定位于邊緣區(qū)外褶和套膜區(qū)的外側(cè)上皮細(xì)胞。RNAi干擾后,Pm HEX在外套膜邊緣區(qū)和套膜區(qū)的表達(dá)量均顯著下調(diào)(P0.05);且貝殼棱柱層和珍珠層微觀結(jié)構(gòu)都出現(xiàn)不同程度的紊亂。因此,Pm HEX參與了貝殼棱柱層和珍珠層的形成。2、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白在與幾丁質(zhì)特異性結(jié)合、鈣化調(diào)控等過程發(fā)揮重要作用。通過克隆獲得馬氏珠母貝幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(Chitin binding protein,CBP)Pm CBP基因全長(zhǎng)序列6 367 bp,編碼2 044個(gè)氨基酸,包含20個(gè)典型的Cht BD2結(jié)構(gòu)域(CBDs),且Cht BD2結(jié)構(gòu)域在物種間具有較高的保守性。QRT-PCR分析表明Pm CBP在外套膜套膜區(qū)表達(dá)量最高(P0.05);ISH分析顯示Pm CBP基因主要分布于外套膜套膜區(qū)外側(cè)上皮細(xì)胞。RNAi干擾后,Pm CBP在外套膜套膜區(qū)的表達(dá)量顯著下調(diào),且貝殼珍珠層結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)紊亂。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Pm CBP的表達(dá)水平與殼重和殼長(zhǎng)呈正相關(guān)(P0.05)。因此,Pm CBP參與了貝殼珍珠層的形成。3、本研究克隆獲得馬氏珠母貝含表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域的蛋白(Epidermal growth factor-like domain-containing protein,EGFCP)Pm EGFCP(PU12)基因全長(zhǎng)1 394 bp,編碼363個(gè)氨基酸,具有2個(gè)保守的表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域(Epidermal growth factor-like domain,EGF)、一個(gè)透明帶結(jié)構(gòu)域(Zona pellucida domain,ZP)。QRT-PCR分析表明Pm EGFCP在外套膜邊緣區(qū)和套膜區(qū)著高表達(dá)(P0.05);ISH檢測(cè)顯示Pm EGFCP主要定位于邊緣區(qū)外褶外側(cè)和中褶內(nèi)側(cè)以及套膜區(qū)外側(cè)上皮細(xì)胞。RNAi干擾后Pm EGFCP在邊緣區(qū)的表達(dá)量顯著下調(diào),且貝殼棱柱層結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)紊亂,珍珠層正常。因此,Pm EGFCP參與了貝殼棱柱層的形成。通過構(gòu)建p ET32a-Pm EGFCP的原核表達(dá)載體,成功誘導(dǎo)表達(dá)了Pm EGFCP重組蛋白,Western blot檢測(cè)其帶有His標(biāo)簽,且與預(yù)測(cè)分子量大小一致。經(jīng)復(fù)性濃縮凍干獲得3mg的Pm EGFCP重組蛋白。4、本研究克隆獲得馬氏珠母貝沒有功能注釋的殼基質(zhì)蛋白基因Pm-PNU7全長(zhǎng)序列797 bp,編碼145個(gè)氨基酸,具有特殊的“KGG”重復(fù)序列和富含天冬氨酸(Asp)序列“DDDDDDHDD”。QRT-PCR分析表明Pm-PNU7基因在外套膜邊緣區(qū)和套膜區(qū)顯著高表達(dá)(P0.05);ISH檢測(cè)顯示Pm-PNU7主要定位于邊緣區(qū)外褶外側(cè)和內(nèi)側(cè)上皮細(xì)胞、中褶內(nèi)側(cè)上皮細(xì)胞以及套膜區(qū)外側(cè)上皮細(xì)胞。RNAi干擾后,Pm-PNU7在外套膜邊緣區(qū)和套膜區(qū)的表達(dá)量均顯著下調(diào),貝殼棱柱層和珍珠層微觀結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)不同程度的紊亂。因此,Pm-PNU7參與了貝殼棱柱層和珍珠層的形成。
【圖文】：

廣東海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文圖2-1 PmHEX的cDNA及氨基酸序列分析注：5’和 3’非編碼區(qū)用小寫字母表示；編碼區(qū)以及推導(dǎo)的氨基酸序列用大寫字母表示；方框內(nèi)的“ATG”和“TAG分別為起始密碼子和終止密碼子；黑色背景部分表示跨膜結(jié)構(gòu)域；陰影部分為碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域；虛線部分為 GH20b 結(jié)構(gòu)域；單劃線部分為 GH20 結(jié)構(gòu)域Fig 2-1 The sequence analysis of cDNA and amino acid of PmHEXNote: 5’ UTR and 3’ UTR are indicated with small letters; Open reading fragment and the deduced amino acid sequenceare indicated with capital letters; “ATG”and “TAG” with a frame represents the initiation codon and stop codon; Thesequence in black background is the transmembrane region; The sequence in gray background is CHB-HEX domain; Thdashed underlined letters represents the Glyco_hydro_20b domain; The single underlined sequence represents theGlyco_hydro_20 domain

為 GH20b 結(jié)構(gòu)域；單劃線部分為 GH20 結(jié)構(gòu)域Fig 2-1 The sequence analysis of cDNA and amino acid of PmHEXand 3’ UTR are indicated with small letters; Open reading fragment and the deduced amin with capital letters; “ATG”and “TAG” with a frame represents the initiation codon and sck background is the transmembrane region; The sequence in gray background is CHB-Herlined letters represents the Glyco_hydro_20b domain; The single underlined sequence rGlyco_hydro_20 domain圖2-2 SMART 預(yù)測(cè)的PmHEX蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)EX：碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域；Glyco_hydro_20b和Glyco_hydro_20：糖族催化結(jié)構(gòu)域；藍(lán)色區(qū)域是信號(hào)肽Fig 2-2 PmHEX protein structure was predicted with SMART softwarEX: Putative carbohydrate binding domain; Glyco_hydro_20b and Glyco_hydro_20: Gly20 family catalytic domain; The blue region is a transmembrane domain
【學(xué)位授予單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2645461