【摘要】：貝殼基質(zhì)蛋白(Shell Matrix Proteins,SMPs)是貝殼形成的主要參與者和功能執(zhí)行者,在有機框架構建和礦物沉積過發(fā)揮重要作用。本課題組前期通過對馬氏珠母貝(Pinctada fucata martensii)貝殼基質(zhì)蛋白質(zhì)組分析,獲得了棱柱層SMPs。本研究對其中的5個SMPs基因進行全長克隆,并通過q RT-PCR、原位雜交(ISH)、RNAi和原核表達技術進行功能驗證。結果如下:1、β-N-乙酰-己糖胺酶(Beta-hexosaminidase/Beta-N-acetylhexosaminidase,HEX)屬于糖苷水解酶20家族(GH20),是幾丁質(zhì)代謝的關鍵水解酶。幾丁質(zhì)作為有機框架主要成分,其代謝在貝殼礦化中發(fā)揮重要作用。本研究克隆獲得2個β-N-乙酰-己糖胺酶基因Pm HEX和Pm HEXL。Pm HEX全長3 813 bp,編碼1 141個氨基酸;Pm HEXL全長2 760bp,編碼774個氨基酸;二者均含有兩個典型的GH20和GH20b結構域和一個碳水化合物結合結構域(CHB-HEX)。QRT-PCR分析表明Pm HEX和Pm HEXL在外套膜邊緣區(qū)(ME)和套膜區(qū)(MP)均顯著高表達,ISH檢測顯示Pm HEX和Pm HEXL均主要定位于邊緣區(qū)外褶和套膜區(qū)的外側上皮細胞。RNAi干擾后,Pm HEX在外套膜邊緣區(qū)和套膜區(qū)的表達量均顯著下調(diào)(P0.05);且貝殼棱柱層和珍珠層微觀結構都出現(xiàn)不同程度的紊亂。因此,Pm HEX參與了貝殼棱柱層和珍珠層的形成。2、幾丁質(zhì)結合蛋白在與幾丁質(zhì)特異性結合、鈣化調(diào)控等過程發(fā)揮重要作用。通過克隆獲得馬氏珠母貝幾丁質(zhì)結合蛋白(Chitin binding protein,CBP)Pm CBP基因全長序列6 367 bp,編碼2 044個氨基酸,包含20個典型的Cht BD2結構域(CBDs),且Cht BD2結構域在物種間具有較高的保守性。QRT-PCR分析表明Pm CBP在外套膜套膜區(qū)表達量最高(P0.05);ISH分析顯示Pm CBP基因主要分布于外套膜套膜區(qū)外側上皮細胞。RNAi干擾后,Pm CBP在外套膜套膜區(qū)的表達量顯著下調(diào),且貝殼珍珠層結構生長紊亂。相關性分析發(fā)現(xiàn)Pm CBP的表達水平與殼重和殼長呈正相關(P0.05)。因此,Pm CBP參與了貝殼珍珠層的形成。3、本研究克隆獲得馬氏珠母貝含表皮生長因子樣結構域的蛋白(Epidermal growth factor-like domain-containing protein,EGFCP)Pm EGFCP(PU12)基因全長1 394 bp,編碼363個氨基酸,具有2個保守的表皮生長因子樣結構域(Epidermal growth factor-like domain,EGF)、一個透明帶結構域(Zona pellucida domain,ZP)。QRT-PCR分析表明Pm EGFCP在外套膜邊緣區(qū)和套膜區(qū)著高表達(P0.05);ISH檢測顯示Pm EGFCP主要定位于邊緣區(qū)外褶外側和中褶內(nèi)側以及套膜區(qū)外側上皮細胞。RNAi干擾后Pm EGFCP在邊緣區(qū)的表達量顯著下調(diào),且貝殼棱柱層結構生長紊亂,珍珠層正常。因此,Pm EGFCP參與了貝殼棱柱層的形成。通過構建p ET32a-Pm EGFCP的原核表達載體,成功誘導表達了Pm EGFCP重組蛋白,Western blot檢測其帶有His標簽,且與預測分子量大小一致。經(jīng)復性濃縮凍干獲得3mg的Pm EGFCP重組蛋白。4、本研究克隆獲得馬氏珠母貝沒有功能注釋的殼基質(zhì)蛋白基因Pm-PNU7全長序列797 bp,編碼145個氨基酸,具有特殊的“KGG”重復序列和富含天冬氨酸(Asp)序列“DDDDDDHDD”。QRT-PCR分析表明Pm-PNU7基因在外套膜邊緣區(qū)和套膜區(qū)顯著高表達(P0.05);ISH檢測顯示Pm-PNU7主要定位于邊緣區(qū)外褶外側和內(nèi)側上皮細胞、中褶內(nèi)側上皮細胞以及套膜區(qū)外側上皮細胞。RNAi干擾后,Pm-PNU7在外套膜邊緣區(qū)和套膜區(qū)的表達量均顯著下調(diào),貝殼棱柱層和珍珠層微觀結構均出現(xiàn)不同程度的紊亂。因此,Pm-PNU7參與了貝殼棱柱層和珍珠層的形成。
【圖文】：

廣東海洋大學碩士學位論文圖2-1 PmHEX的cDNA及氨基酸序列分析注：5’和 3’非編碼區(qū)用小寫字母表示；編碼區(qū)以及推導的氨基酸序列用大寫字母表示；方框內(nèi)的“ATG”和“TAG分別為起始密碼子和終止密碼子；黑色背景部分表示跨膜結構域；陰影部分為碳水化合物結合結構域；虛線部分為 GH20b 結構域；單劃線部分為 GH20 結構域Fig 2-1 The sequence analysis of cDNA and amino acid of PmHEXNote: 5’ UTR and 3’ UTR are indicated with small letters; Open reading fragment and the deduced amino acid sequenceare indicated with capital letters; “ATG”and “TAG” with a frame represents the initiation codon and stop codon; Thesequence in black background is the transmembrane region; The sequence in gray background is CHB-HEX domain; Thdashed underlined letters represents the Glyco_hydro_20b domain; The single underlined sequence represents theGlyco_hydro_20 domain

為 GH20b 結構域；單劃線部分為 GH20 結構域Fig 2-1 The sequence analysis of cDNA and amino acid of PmHEXand 3’ UTR are indicated with small letters; Open reading fragment and the deduced amin with capital letters; “ATG”and “TAG” with a frame represents the initiation codon and sck background is the transmembrane region; The sequence in gray background is CHB-Herlined letters represents the Glyco_hydro_20b domain; The single underlined sequence rGlyco_hydro_20 domain圖2-2 SMART 預測的PmHEX蛋白質(zhì)結構EX：碳水化合物結合結構域；Glyco_hydro_20b和Glyco_hydro_20：糖族催化結構域；藍色區(qū)域是信號肽Fig 2-2 PmHEX protein structure was predicted with SMART softwarEX: Putative carbohydrate binding domain; Glyco_hydro_20b and Glyco_hydro_20: Gly20 family catalytic domain; The blue region is a transmembrane domain
【學位授予單位】：廣東海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2645461