【摘要】：視黃酸(retinoic acid,RA)是一種內(nèi)源信號(hào)分子,通過(guò)與核受體RAR(retinoic acid receptor)及RXR(retinoic acid receptor)結(jié)合發(fā)揮其調(diào)控作用,視黃酸信號(hào)途徑異常會(huì)引起先天性疾病如心臟病、神經(jīng)系統(tǒng)缺陷及身體畸形等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,乙醛脫氫酶 1a(Aldehyde dehydrogenases 1A,Aldh1a)家族中Aldh1a1、Aldh1a2、Aldh1a3、Aldh1a4基因產(chǎn)物都具有視黃醛脫氫酶的功能,參與視黃酸在體內(nèi)的生物合成。但乙醛脫氫酶 4a1(Aldehydedehydrogenases4a1,Aldh4a1)是否具有視黃醛脫氫酶的功能未見(jiàn)報(bào)道,仍待探究。本論文取得以下結(jié)果:(1)運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚(yú)Aldh4a1,并篩選得到移碼突變(-5bp)的純合突變體F2代,產(chǎn)生編碼143個(gè)氨基酸的截短蛋白。(2)用RT-PCR及qRT-PCR研究Aldh4a1在野生斑馬魚(yú)早期胚胎各個(gè)時(shí)期及成體各組織器官的表達(dá)情況,結(jié)果表明其為母源表達(dá),隨著時(shí)間的推移mRNA量逐漸下降,在發(fā)育到24h時(shí)合子基因表達(dá)量達(dá)到高峰,且在精巢、肌肉表達(dá)量較高,在卵巢及其他組織器官中表達(dá)較低。(3)Aldh4a1雜合F1代突變體互交,部分F2斑馬魚(yú)在發(fā)育到第四天左右時(shí)死亡,單個(gè)提取死亡的斑馬魚(yú)的基因組并檢測(cè)其基因型,發(fā)現(xiàn)都是Aldh4aI-/-純合突變體,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示其占所有F2代胚胎的25%,隨機(jī)檢測(cè)正常表型的胚胎,其基因型為野生型或雜合體,未見(jiàn)突變純合體。證明Aldh4a1為隱性致死基因。(4)觀(guān)察Aldh4al純合突變體表型,發(fā)現(xiàn)心包囊腫,其頭部眼部變小,體節(jié)變短彎曲,色素變少,形態(tài)異常。(5)原位雜交表明心室特異性肌球蛋白重鏈基因vwhc(ventricular myosin heavy chain)在36hpf Aldh4a1純合突變體心室的表達(dá)向后方擴(kuò)展,且在心前區(qū)位置表達(dá)量增加,心房特異性肌球蛋白重鏈基因amhc(atrial myosin heavy chain)在36hpf Aldh4a1純合突變體心房的表達(dá)量降低且表達(dá)范圍減少,顯示心臟發(fā)育異常。(6)于顯微鏡下統(tǒng)計(jì)Aldh4a1-/-心率,發(fā)現(xiàn)其心率較野生型明顯降低,血液循環(huán)減弱。(7)原位雜交表明HuC在48hpf斑馬魚(yú)大腦中的表達(dá)量明顯降低,且在其后腦位置表達(dá)量降低最為顯著,顯示大腦發(fā)育異常。(8)將72hpf的Aldh4a1純合突變體和72hpf野生型斑馬魚(yú)于顯微鏡下,給予相同的外界刺激,發(fā)現(xiàn)Aldh4a1純合突變體不能對(duì)外界的刺激做出反應(yīng),應(yīng)激反應(yīng)基本消失。(9)原位雜交共定位以myod(myogenic differentiation)標(biāo)記體節(jié),以krox20標(biāo)記菱腦節(jié)3及菱腦節(jié)5,在Aldh4a1純合突變體中顯示菱腦節(jié)5和第一體節(jié)之間的距離相對(duì)縮短。(10)阿爾新蘭染色分析表明,Aldh4a1純合突變體的咽弓軟骨發(fā)育異常,其中下頜弓以及腭方軟骨完全消失,舌骨弓體積減小,且沒(méi)有胸鰭。(11)視黃酸補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)表明,外源性添加一定劑量的視黃酸,Aldh4a1純合突變體的異常表型消失,證明了Aldh4a 也是一種是視黃醛脫氫酶,參與視黃酸的生物合成過(guò)程。本論文還運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除Cldn7基因,擬研究其對(duì)雄性斑馬魚(yú)生殖的影響。得到-4bp的Cldn7b雜合突變體。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：Q344

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2644968