【摘要】：視黃酸(retinoic acid,RA)是一種內(nèi)源信號分子,通過與核受體RAR(retinoic acid receptor)及RXR(retinoic acid receptor)結(jié)合發(fā)揮其調(diào)控作用,視黃酸信號途徑異常會引起先天性疾病如心臟病、神經(jīng)系統(tǒng)缺陷及身體畸形等。據(jù)文獻報道,乙醛脫氫酶 1a(Aldehyde dehydrogenases 1A,Aldh1a)家族中Aldh1a1、Aldh1a2、Aldh1a3、Aldh1a4基因產(chǎn)物都具有視黃醛脫氫酶的功能,參與視黃酸在體內(nèi)的生物合成。但乙醛脫氫酶 4a1(Aldehydedehydrogenases4a1,Aldh4a1)是否具有視黃醛脫氫酶的功能未見報道,仍待探究。本論文取得以下結(jié)果:(1)運用CRISPR/Cas9技術敲除斑馬魚Aldh4a1,并篩選得到移碼突變(-5bp)的純合突變體F2代,產(chǎn)生編碼143個氨基酸的截短蛋白。(2)用RT-PCR及qRT-PCR研究Aldh4a1在野生斑馬魚早期胚胎各個時期及成體各組織器官的表達情況,結(jié)果表明其為母源表達,隨著時間的推移mRNA量逐漸下降,在發(fā)育到24h時合子基因表達量達到高峰,且在精巢、肌肉表達量較高,在卵巢及其他組織器官中表達較低。(3)Aldh4a1雜合F1代突變體互交,部分F2斑馬魚在發(fā)育到第四天左右時死亡,單個提取死亡的斑馬魚的基因組并檢測其基因型,發(fā)現(xiàn)都是Aldh4aI-/-純合突變體,統(tǒng)計結(jié)果顯示其占所有F2代胚胎的25%,隨機檢測正常表型的胚胎,其基因型為野生型或雜合體,未見突變純合體。證明Aldh4a1為隱性致死基因。(4)觀察Aldh4al純合突變體表型,發(fā)現(xiàn)心包囊腫,其頭部眼部變小,體節(jié)變短彎曲,色素變少,形態(tài)異常。(5)原位雜交表明心室特異性肌球蛋白重鏈基因vwhc(ventricular myosin heavy chain)在36hpf Aldh4a1純合突變體心室的表達向后方擴展,且在心前區(qū)位置表達量增加,心房特異性肌球蛋白重鏈基因amhc(atrial myosin heavy chain)在36hpf Aldh4a1純合突變體心房的表達量降低且表達范圍減少,顯示心臟發(fā)育異常。(6)于顯微鏡下統(tǒng)計Aldh4a1-/-心率,發(fā)現(xiàn)其心率較野生型明顯降低,血液循環(huán)減弱。(7)原位雜交表明HuC在48hpf斑馬魚大腦中的表達量明顯降低,且在其后腦位置表達量降低最為顯著,顯示大腦發(fā)育異常。(8)將72hpf的Aldh4a1純合突變體和72hpf野生型斑馬魚于顯微鏡下,給予相同的外界刺激,發(fā)現(xiàn)Aldh4a1純合突變體不能對外界的刺激做出反應,應激反應基本消失。(9)原位雜交共定位以myod(myogenic differentiation)標記體節(jié),以krox20標記菱腦節(jié)3及菱腦節(jié)5,在Aldh4a1純合突變體中顯示菱腦節(jié)5和第一體節(jié)之間的距離相對縮短。(10)阿爾新蘭染色分析表明,Aldh4a1純合突變體的咽弓軟骨發(fā)育異常,其中下頜弓以及腭方軟骨完全消失,舌骨弓體積減小,且沒有胸鰭。(11)視黃酸補償實驗表明,外源性添加一定劑量的視黃酸,Aldh4a1純合突變體的異常表型消失,證明了Aldh4a 也是一種是視黃醛脫氫酶,參與視黃酸的生物合成過程。本論文還運用CRISPR/Cas9技術敲除Cldn7基因,擬研究其對雄性斑馬魚生殖的影響。得到-4bp的Cldn7b雜合突變體。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q344

【參考文獻】

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2 劉薇廷，寧壽葆，華邦杰，，陳應泰，周世瑜，郭安玲，陳樹寶，周愛卿，張子珊，周韋;上海市楊浦、徐匯區(qū)小兒先天性心臟病發(fā)病率及其特點[J];中華兒科雜志;1995年06期

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本文編號：2644968