【摘要】：隨著轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化生產(chǎn)以來(lái),種植面積不斷擴(kuò)大,關(guān)于轉(zhuǎn)基因食品的生物安全性爭(zhēng)議成為熱點(diǎn)問(wèn)題,受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。轉(zhuǎn)基因玉米是最早獲得商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物之一,也是世界上種植面積最大的轉(zhuǎn)基因經(jīng)濟(jì)、糧食作物。玉米作為我國(guó)的主要糧食之一,同時(shí)也是研究較多的模式植物。本文以轉(zhuǎn)cry1Ab和epsps基因抗蟲(chóng)耐除草劑玉米為材料,通過(guò)確定該轉(zhuǎn)基因玉米的外源插入片段全序列、插入位點(diǎn)、側(cè)翼序列和拷貝數(shù)等信息,為轉(zhuǎn)基因玉米的安全評(píng)價(jià)提供分子特征方面的依據(jù)。研究結(jié)果表明:1.明確了轉(zhuǎn)cry1Ab和epsps基因抗蟲(chóng)耐除草劑玉米的分子特征信息(1)通過(guò)常規(guī)PCR技術(shù),對(duì)插入元件進(jìn)行檢測(cè)。基于長(zhǎng)鏈PCR原理,利用高保真酶對(duì)插入片段側(cè)翼序列進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果分析,確定了插入序列的全長(zhǎng)為12499 bp,轉(zhuǎn)入序列插入于玉米Chr01染色體,第271,871,046位點(diǎn)上。(2)利用Southern bloting和微流滴數(shù)字PCR兩種方法對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)耐除草劑玉米外源插入序列的拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定,確定了目的基因?yàn)閱慰截悺?.建立了轉(zhuǎn)cry1Ab和epsps基因抗蟲(chóng)耐除草劑玉米的轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR方法以轉(zhuǎn)化體特異性序列為靶標(biāo),設(shè)計(jì)了特異性引物,并對(duì)特異性、反應(yīng)體系、反應(yīng)程序進(jìn)行了優(yōu)化和確定。主要為:(1)采用常規(guī)PCR方法,確定了轉(zhuǎn)cry1Ab和epsps基因抗蟲(chóng)耐除草劑玉米特異性引物,上游引物為5'-CAGTACTAAAATCCAGATCCCCCGA-3',下游引物為5'-CAGACGACGGTCCGCTAA-3',預(yù)期擴(kuò)增片段大小為259 bp。(2)采用常規(guī)PCR方法,確定了最合適的引物濃度為0.4μmol/L,退火溫度為58℃。(3)采用常規(guī)PCR方法,確定了特異性良好的檢測(cè)方法,檢出限為0.1%,滿足轉(zhuǎn)基因生物安全檢測(cè)監(jiān)管的需求。
【圖文】：

83 年，美國(guó)誕生了全世界首例轉(zhuǎn)基因煙草，隨后又成功繁育出轉(zhuǎn)基因ryski P et al.1983）。1996 年，轉(zhuǎn)基因作物開(kāi)始進(jìn)行全球商業(yè)化應(yīng)用，截經(jīng)有 26 個(gè)國(guó)家種植了 1.851 億公頃轉(zhuǎn)基因作物，比 2015 年的 1.797 億 萬(wàn)公頃，即增加了 3%，除 2015 年以外，這是第 20 個(gè)增長(zhǎng)年份。最近技術(shù)無(wú)疑為育種家們研制新的具有良好優(yōu)良性狀的作物提供了一種新著轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的的大量應(yīng)用，世界各國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的看愈多，因此轉(zhuǎn)基因作物對(duì)人畜環(huán)境潛在的風(fēng)險(xiǎn)也是我們必須考慮的。國(guó)是全球范圍內(nèi)開(kāi)放轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植最早和轉(zhuǎn)基因作物種植面2016 年美國(guó)轉(zhuǎn)基因作物的種植面積達(dá)到 7 290 萬(wàn)公頃，其次為巴西(4根廷( 2380 萬(wàn)公頃)、加拿大(1160 萬(wàn)公頃)和印度(1080 萬(wàn)公頃) (如的種植面積為 1．682億公頃，占全球種植面積的 91%（James C2016）

表 2-1 zSSIIb 基因定性 PCR 擴(kuò)增體系試劑Reagent、。體積Volume2×Green Master Mix 25 μL正向引物-F 2 μL反向引物-R 2 μLDNA 4 μLddH2O 17 μL總體積 50 μL擴(kuò)增程序如下：94 ℃變性 5 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，，72 ℃延伸 30s，共進(jìn)行 35 次循環(huán)；72 ℃延伸 5 min；10 ℃保存；擴(kuò)增結(jié)束后使用電泳檢測(cè)。2.2.3 轉(zhuǎn)基因元件篩選檢測(cè)2.2.3.1 常見(jiàn)轉(zhuǎn)基因元件篩選根據(jù)查詢相關(guān)文獻(xiàn)獲得的信息，初步繪制出轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)耐除草劑玉米的構(gòu)建線性圖，包括了各個(gè)插入元件（外源基因、標(biāo)志基因、啟動(dòng)子、內(nèi)含子、終止子等）的位置。構(gòu)建線性圖示意圖如圖 2-1 所示。
【學(xué)位授予單位】：天津農(nóng)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S513

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2644907