【摘要】：隨著轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化生產(chǎn)以來,種植面積不斷擴大,關于轉(zhuǎn)基因食品的生物安全性爭議成為熱點問題,受到國內(nèi)外的廣泛關注。轉(zhuǎn)基因玉米是最早獲得商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物之一,也是世界上種植面積最大的轉(zhuǎn)基因經(jīng)濟、糧食作物。玉米作為我國的主要糧食之一,同時也是研究較多的模式植物。本文以轉(zhuǎn)cry1Ab和epsps基因抗蟲耐除草劑玉米為材料,通過確定該轉(zhuǎn)基因玉米的外源插入片段全序列、插入位點、側(cè)翼序列和拷貝數(shù)等信息,為轉(zhuǎn)基因玉米的安全評價提供分子特征方面的依據(jù)。研究結果表明:1.明確了轉(zhuǎn)cry1Ab和epsps基因抗蟲耐除草劑玉米的分子特征信息(1)通過常規(guī)PCR技術,對插入元件進行檢測�；陂L鏈PCR原理,利用高保真酶對插入片段側(cè)翼序列進行測定。經(jīng)PCR擴增和測序結果分析,確定了插入序列的全長為12499 bp,轉(zhuǎn)入序列插入于玉米Chr01染色體,第271,871,046位點上。(2)利用Southern bloting和微流滴數(shù)字PCR兩種方法對轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米外源插入序列的拷貝數(shù)進行測定,確定了目的基因為單拷貝。2.建立了轉(zhuǎn)cry1Ab和epsps基因抗蟲耐除草劑玉米的轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR方法以轉(zhuǎn)化體特異性序列為靶標,設計了特異性引物,并對特異性、反應體系、反應程序進行了優(yōu)化和確定。主要為:(1)采用常規(guī)PCR方法,確定了轉(zhuǎn)cry1Ab和epsps基因抗蟲耐除草劑玉米特異性引物,上游引物為5'-CAGTACTAAAATCCAGATCCCCCGA-3',下游引物為5'-CAGACGACGGTCCGCTAA-3',預期擴增片段大小為259 bp。(2)采用常規(guī)PCR方法,確定了最合適的引物濃度為0.4μmol/L,退火溫度為58℃。(3)采用常規(guī)PCR方法,確定了特異性良好的檢測方法,檢出限為0.1%,滿足轉(zhuǎn)基因生物安全檢測監(jiān)管的需求。
【圖文】：

83 年，美國誕生了全世界首例轉(zhuǎn)基因煙草，隨后又成功繁育出轉(zhuǎn)基因ryski P et al.1983）。1996 年，轉(zhuǎn)基因作物開始進行全球商業(yè)化應用，截經(jīng)有 26 個國家種植了 1.851 億公頃轉(zhuǎn)基因作物，比 2015 年的 1.797 億 萬公頃，即增加了 3%，除 2015 年以外，這是第 20 個增長年份。最近技術無疑為育種家們研制新的具有良好優(yōu)良性狀的作物提供了一種新著轉(zhuǎn)基因技術在農(nóng)業(yè)領域的的大量應用，世界各國對轉(zhuǎn)基因作物的看愈多，因此轉(zhuǎn)基因作物對人畜環(huán)境潛在的風險也是我們必須考慮的。國是全球范圍內(nèi)開放轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植最早和轉(zhuǎn)基因作物種植面2016 年美國轉(zhuǎn)基因作物的種植面積達到 7 290 萬公頃，其次為巴西(4根廷( 2380 萬公頃)、加拿大(1160 萬公頃)和印度(1080 萬公頃) (如的種植面積為 1．682億公頃，占全球種植面積的 91%（James C2016）

表 2-1 zSSIIb 基因定性 PCR 擴增體系試劑Reagent、。體積Volume2×Green Master Mix 25 μL正向引物-F 2 μL反向引物-R 2 μLDNA 4 μLddH2O 17 μL總體積 50 μL擴增程序如下：94 ℃變性 5 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，，72 ℃延伸 30s，共進行 35 次循環(huán)；72 ℃延伸 5 min；10 ℃保存；擴增結束后使用電泳檢測。2.2.3 轉(zhuǎn)基因元件篩選檢測2.2.3.1 常見轉(zhuǎn)基因元件篩選根據(jù)查詢相關文獻獲得的信息，初步繪制出轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米的構建線性圖，包括了各個插入元件（外源基因、標志基因、啟動子、內(nèi)含子、終止子等）的位置。構建線性圖示意圖如圖 2-1 所示。
【學位授予單位】：天津農(nóng)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S513

【參考文獻】

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本文編號：2644907