發(fā)布時(shí)間：2020-04-29 06:58

【摘要】：為探索在馬鈴薯中表達(dá)玉米源核糖體失活蛋白基因(RIP)是否可以改善受體對(duì)真菌病原立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)的抗性,本研究以根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404(p2301-RIP)轉(zhuǎn)化馬鈴薯易感品種"Favorita"并進(jìn)行了目的基因表達(dá)的分子生物學(xué)鑒定和對(duì)R.Solani的抗病性鑒定。結(jié)果表明:卡那霉素抗性再生株系的基因組中擴(kuò)增到了目的基因,經(jīng)Southern印記分析證實(shí)各獨(dú)立轉(zhuǎn)化株系基因組中均整合了2個(gè)拷貝RIP基因;RT-PCR分析表明RIP基因在轉(zhuǎn)錄水平正常表達(dá);酶促活性測(cè)定表明部分轉(zhuǎn)基因植株蛋白提取物具有RIP基因產(chǎn)物應(yīng)有的脫嘌呤活性;溫室盆栽試驗(yàn)證實(shí)有1個(gè)轉(zhuǎn)基因株系顯著提高了對(duì)由R.Solani引起的馬鈴薯黑痣病的抗性。
【圖文】：

基因改善馬鈴薯對(duì)R.solani抗性的效果。1結(jié)果與分析1.1卡那霉素抗性株系RIP基因擴(kuò)增利用含有重組質(zhì)粒p2301-RIP的農(nóng)桿菌LBA4-404侵染馬鈴薯基因型“Favorita”的葉圓片外植體，成功獲得了卡那霉素抗性植株。以“Favorita”(“64”)基因組DNA為對(duì)照，利用RIP基因特異引物RIP-F和RIP-R對(duì)卡那霉素抗性株系試管苗葉片的基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明：未轉(zhuǎn)化對(duì)照“64”未擴(kuò)增出特異條帶，而所有轉(zhuǎn)基因再生植株系增出了約925bp的特異片段(部分株系RIP基因PCR結(jié)果(圖1)，初步證明外源基因已被轉(zhuǎn)入到受體基因型Favorita中。1.2目的基因PCR陽(yáng)性馬鈴薯株系Southern雜交鑒定Southern印記分析(以EcoRⅠ/HindⅢ消化馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系及未轉(zhuǎn)化對(duì)照基因組DNA,使用的雜交探針為是質(zhì)粒為模板,對(duì)RIP基因PCR所獲地高辛標(biāo)記探針)表明：RIP基因整合到了供試轉(zhuǎn)化株系基因組中。在這些轉(zhuǎn)化體中，均檢測(cè)到2條雜交帶(圖2)。圖2展示了3個(gè)PCR陽(yáng)性株系(FT-3,FT-4,FT-6)的Southern印記與由重組質(zhì)粒RIP基因PCR產(chǎn)物dUTP標(biāo)記探針的雜交結(jié)果。各有2條雜交帶表明這些轉(zhuǎn)基因株系中均插入了2個(gè)拷貝的RIP基因。雜交帶的大小不同表明轉(zhuǎn)化體中2個(gè)拷貝的RIP基因在其基因組中隨機(jī)插入的位點(diǎn)也不同。RIP基因在由同一愈傷組織而來(lái)的再生株系(FT-3與FT-6)基因組中的整合模式相同，它們與來(lái)自另一個(gè)愈傷組織的株系(FT-4)整合模式則不相同。在未轉(zhuǎn)化對(duì)照(64R)中未檢測(cè)到目的基因。1.3轉(zhuǎn)基因馬鈴薯RT-PCR檢測(cè)提取部分Southern雜交陽(yáng)性株系的RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，在以ef1-αF和ef1-αR為圖1卡那霉素抗性株系RIP基因PCR鑒定

基因在轉(zhuǎn)錄水平得到表達(dá)。1.4RIP脫嘌呤活性分析按Tanpure等(2012)的方法測(cè)定熒光值后，對(duì)熒光值用DPS軟件進(jìn)行方差分析(表1)，結(jié)果表明：除FT-4熒光值與未轉(zhuǎn)化對(duì)照“64R”差異不顯著外，其他RT-PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系熒光值均極顯著低于未轉(zhuǎn)化對(duì)照“64R”，說(shuō)明其RIP脫嘌呤活性均極顯著高于未轉(zhuǎn)化對(duì)照。1.5轉(zhuǎn)基因株系塊莖對(duì)R.Solani抗性鑒定根據(jù)對(duì)各株系塊莖由R.Solani引起的黑痣病發(fā)生情況的調(diào)查結(jié)果，并對(duì)計(jì)算所得病情指數(shù)進(jìn)行方差分析，，結(jié)果(表2)表明：由“Ⅱ”號(hào)愈傷組織上產(chǎn)生圖2馬鈴薯品種“Favorita”的Southern印記分析注:M:地高辛標(biāo)記分子標(biāo)準(zhǔn)物λ/HindⅢ(Roche);C-:未轉(zhuǎn)化對(duì)照“64R”HindⅢ酶切消化產(chǎn)物(陰性對(duì)照);C+:質(zhì)粒p2301-RIPDNA以EcoRⅠ酶切消化產(chǎn)物(陽(yáng)性對(duì)照);3E和3H:目的基因PCR陽(yáng)性株系FT-3分別以EcoRⅠ,HindⅢ酶解產(chǎn)物;4E和4H:目的基因PCR陽(yáng)性株系FT-4分別以EcoRⅠ,HindⅢ酶解產(chǎn)物;6E和6H:目的基因PCR陽(yáng)性株系FT-6分別以EcoRⅠ,HindⅢ酶解產(chǎn)物Figure2Southernblotanalysisofthecv.‘Favorita’Note:M:DIG-labeledmolecularweightmarkerλ/HindⅢ;C-:Non-transformedcontroldigestedwithHindⅢ;C+:Theplasmidp2301-RIPDNAtemplatedigestedwithEcoRⅠaspositivecon-trol;3Eand3H:Independenttransgenicclone‘FT-3’transformedwiththep2301-RIPandgenomicDNAdigestedwithEcoRⅠandHindⅢrespectively;4Eand4H:Independenttransgenicclone‘FT-4’transformedwiththep2301-RIPanddigestedwithEcoRⅠandHindⅢrespectively;6Eand6H:Independenttrans-

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