【摘要】：生長(zhǎng)素抑制蛋白(Auxin repressed protein,ARP)基因在植物界中分布廣泛,且已被證實(shí)在一些植物的生長(zhǎng)與防御以及種子休眠等過程中扮演重要的角色。但是,目前水稻生長(zhǎng)素抑制基因Os ARP1的結(jié)構(gòu)特征、表達(dá)特性以及生物學(xué)功能特別是與稻瘟病之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。本文采用生物信息學(xué)方法,分析水稻Os ARP1及其功能相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、啟動(dòng)子順式作用元件、編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征;重點(diǎn)以感病品種TP309和轉(zhuǎn)基因抗病品種TP309-Pid3為材料,研究稻瘟病菌感染過程中水稻Os ARP1及功能相關(guān)基因的表達(dá)水平,并采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建OsARP1基因CRISPR/Cas9敲除載體、RNAi載體和過表達(dá)載體,以獲得轉(zhuǎn)基因水稻,鑒定轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性。旨在初步了解水稻生長(zhǎng)素抑制基因OsARP1與Pid3介導(dǎo)的稻瘟病抗性的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:1.通過對(duì)水稻生長(zhǎng)素抑制基因Os ARP1及5個(gè)家族基因的生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)OsARP1以及LOC_Os03g22270、LOC_Os08g35190、LOC_Os09g26620等4個(gè)基因編碼蛋白的氨基酸序列中都含有生長(zhǎng)素相關(guān)的結(jié)構(gòu)域,其2kb的啟動(dòng)子區(qū)都含有水楊酸、脫落酸以及茉莉酸等防御激素類的順式作用元件;這些基因編碼蛋白沒有被信號(hào)肽修飾,沒有跨膜結(jié)構(gòu)域,普遍存在著蘇氨酸(T)、絲氨酸(S)、酪氨酸(Y)磷酸化位點(diǎn);Os ARP1基因編碼蛋白預(yù)測(cè)作用場(chǎng)所在細(xì)胞質(zhì)(可信度0.450),LOC_Os03g22270和LOC_Os09g26620編碼蛋白的作用場(chǎng)所都在細(xì)胞質(zhì)(可信度分別是0.650和0.600),LOC_Os08g35190基因的作用場(chǎng)所在細(xì)胞核(可信度0.650)。2.用稻瘟病菌Zhong 10-8-14接種感病水稻品種TP309和轉(zhuǎn)基因抗病水稻品種TP309-Pid3,通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Os ARP1及LOC_Os03g22270、LOC_Os08g35190、LOC_Os09g26620等4個(gè)基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示,在感染稻瘟病菌后水稻OsARP1及其功能相關(guān)基因都能被誘導(dǎo)表達(dá),其中OsARP1基因被誘導(dǎo)的幅度最大;與感病品種相比,抗病品種Os ARP1基因被誘導(dǎo)表達(dá)的速度更快、幅度更高。表明OsARP1基因在水稻對(duì)稻瘟病菌抗病信號(hào)通路中可能起重要作用。3.將敲除和沉默OsARP1基因的載體轉(zhuǎn)化TP309和TP309-Pid3后,水稻愈傷組織生長(zhǎng)緩慢,黃化嚴(yán)重,分化出的再生植株在沒有形成根之前黃化最后死亡,很難獲得再生植株。過表達(dá)Os ARP1基因的載體轉(zhuǎn)化TP309后,大部分愈傷分化出的再生植株生命力太弱很難存活,僅獲得了7株轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)過潮霉素抗性檢測(cè)和OsARP1基因的表達(dá)量檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有6株的表達(dá)量是下調(diào),僅1株的OsARP1基因表達(dá)量上調(diào)。對(duì)表達(dá)量上調(diào)的轉(zhuǎn)基因水稻接種稻瘟病菌后,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Os ARP1能增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性。本文對(duì)OsARP1基因與水稻對(duì)稻瘟病菌抗性的關(guān)系進(jìn)行討論,初步認(rèn)為Os ARP1基因與水稻對(duì)稻瘟病菌抗性之間有密切關(guān)系。同時(shí)對(duì)獲得OsARP1基因敲除和沉默轉(zhuǎn)基因植株的困難進(jìn)行討論。
【圖文】：

水稻組織培養(yǎng)過程

圖 2.2 稻瘟病菌培養(yǎng)及熒光顯微鏡下觀察孢子Fig.2.2 The spore of rice blast and fluorescence microscopy（2）稻瘟病菌的接菌方法：噴霧法和注射法a. 噴霧法：噴霧法一般我們是在水稻四葉期進(jìn)行，首先將濃度為 5×104個(gè)/ml的孢子懸浮液，，按體積比 1000:1 的方法加入 20% Tween-20 附著劑，以增強(qiáng)孢子與水稻葉片的附著力，使孢子更好的附著在葉片上，再用噴壺均勻的噴灑使孢子懸浮液布滿整個(gè)葉片，即完成接菌。b. 注射法：注射法我們通常在水稻分蘗期進(jìn)行，首先將配置好的 5×104個(gè)/ml懸浮液，混勻后吸入普通的醫(yī)用注射器。對(duì)水稻進(jìn)行注射，我們先從莖中部將孢子懸浮液注入，注射器的針頭必須在莖的中空部分，這樣才能使孢子懸浮液成功注入到水稻組織中，約 1ml-2ml 的孢子懸浮液即可。若注射成功則孢子懸浮液會(huì)從莖的基部流入至頂部，然后懸浮液會(huì)從水稻莖桿頂部溢出，即完成接菌。對(duì)于表型的鑒定，我們是在接菌 7 天后觀察水稻葉片的抗感情況。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.111.41

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 鄂志國(guó);張麗靖;焦桂愛;程本義;王磊;;稻瘟病抗性基因的鑒定及利用進(jìn)展[J];中國(guó)水稻科學(xué);2008年05期

2 劉占領(lǐng);雷財(cái)林;程治軍;李偉;王久林;時(shí)克;;水稻稻瘟病抗性基因定位與克隆研究進(jìn)展[J];作物雜志;2007年03期

3 朱小源,楊祁云,楊健源,雷財(cái)林,王久林,凌忠專;抗稻瘟病單基因系對(duì)秈稻稻瘟病菌小種鑒別力分析[J];植物病理學(xué)報(bào);2004年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 龐志乾;水稻Pid3抗病基因介導(dǎo)稻瘟病免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組分析[D];中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所;2013年

本文編號(hào)：2644103