【摘要】：生長素抑制蛋白(Auxin repressed protein,ARP)基因在植物界中分布廣泛,且已被證實在一些植物的生長與防御以及種子休眠等過程中扮演重要的角色。但是,目前水稻生長素抑制基因Os ARP1的結(jié)構(gòu)特征、表達特性以及生物學(xué)功能特別是與稻瘟病之間的關(guān)系尚未見報道。本文采用生物信息學(xué)方法,分析水稻Os ARP1及其功能相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)特點、啟動子順式作用元件、編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征;重點以感病品種TP309和轉(zhuǎn)基因抗病品種TP309-Pid3為材料,研究稻瘟病菌感染過程中水稻Os ARP1及功能相關(guān)基因的表達水平,并采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建OsARP1基因CRISPR/Cas9敲除載體、RNAi載體和過表達載體,以獲得轉(zhuǎn)基因水稻,鑒定轉(zhuǎn)基因水稻對稻瘟病菌的抗性。旨在初步了解水稻生長素抑制基因OsARP1與Pid3介導(dǎo)的稻瘟病抗性的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:1.通過對水稻生長素抑制基因Os ARP1及5個家族基因的生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)OsARP1以及LOC_Os03g22270、LOC_Os08g35190、LOC_Os09g26620等4個基因編碼蛋白的氨基酸序列中都含有生長素相關(guān)的結(jié)構(gòu)域,其2kb的啟動子區(qū)都含有水楊酸、脫落酸以及茉莉酸等防御激素類的順式作用元件;這些基因編碼蛋白沒有被信號肽修飾,沒有跨膜結(jié)構(gòu)域,普遍存在著蘇氨酸(T)、絲氨酸(S)、酪氨酸(Y)磷酸化位點;Os ARP1基因編碼蛋白預(yù)測作用場所在細(xì)胞質(zhì)(可信度0.450),LOC_Os03g22270和LOC_Os09g26620編碼蛋白的作用場所都在細(xì)胞質(zhì)(可信度分別是0.650和0.600),LOC_Os08g35190基因的作用場所在細(xì)胞核(可信度0.650)。2.用稻瘟病菌Zhong 10-8-14接種感病水稻品種TP309和轉(zhuǎn)基因抗病水稻品種TP309-Pid3,通過RT-PCR技術(shù)檢測Os ARP1及LOC_Os03g22270、LOC_Os08g35190、LOC_Os09g26620等4個基因的表達量。結(jié)果顯示,在感染稻瘟病菌后水稻OsARP1及其功能相關(guān)基因都能被誘導(dǎo)表達,其中OsARP1基因被誘導(dǎo)的幅度最大;與感病品種相比,抗病品種Os ARP1基因被誘導(dǎo)表達的速度更快、幅度更高。表明OsARP1基因在水稻對稻瘟病菌抗病信號通路中可能起重要作用。3.將敲除和沉默OsARP1基因的載體轉(zhuǎn)化TP309和TP309-Pid3后,水稻愈傷組織生長緩慢,黃化嚴(yán)重,分化出的再生植株在沒有形成根之前黃化最后死亡,很難獲得再生植株。過表達Os ARP1基因的載體轉(zhuǎn)化TP309后,大部分愈傷分化出的再生植株生命力太弱很難存活,僅獲得了7株轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)過潮霉素抗性檢測和OsARP1基因的表達量檢測,發(fā)現(xiàn)有6株的表達量是下調(diào),僅1株的OsARP1基因表達量上調(diào)。對表達量上調(diào)的轉(zhuǎn)基因水稻接種稻瘟病菌后,發(fā)現(xiàn)過表達Os ARP1能增強水稻對稻瘟病菌的抗性。本文對OsARP1基因與水稻對稻瘟病菌抗性的關(guān)系進行討論,初步認(rèn)為Os ARP1基因與水稻對稻瘟病菌抗性之間有密切關(guān)系。同時對獲得OsARP1基因敲除和沉默轉(zhuǎn)基因植株的困難進行討論。
【圖文】：

水稻組織培養(yǎng)過程

圖 2.2 稻瘟病菌培養(yǎng)及熒光顯微鏡下觀察孢子Fig.2.2 The spore of rice blast and fluorescence microscopy（2）稻瘟病菌的接菌方法：噴霧法和注射法a. 噴霧法：噴霧法一般我們是在水稻四葉期進行，首先將濃度為 5×104個/ml的孢子懸浮液，，按體積比 1000:1 的方法加入 20% Tween-20 附著劑，以增強孢子與水稻葉片的附著力，使孢子更好的附著在葉片上，再用噴壺均勻的噴灑使孢子懸浮液布滿整個葉片，即完成接菌。b. 注射法：注射法我們通常在水稻分蘗期進行，首先將配置好的 5×104個/ml懸浮液，混勻后吸入普通的醫(yī)用注射器。對水稻進行注射，我們先從莖中部將孢子懸浮液注入，注射器的針頭必須在莖的中空部分，這樣才能使孢子懸浮液成功注入到水稻組織中，約 1ml-2ml 的孢子懸浮液即可。若注射成功則孢子懸浮液會從莖的基部流入至頂部，然后懸浮液會從水稻莖桿頂部溢出，即完成接菌。對于表型的鑒定，我們是在接菌 7 天后觀察水稻葉片的抗感情況。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S435.111.41

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

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本文編號：2644103