【摘要】：SERKs是體細(xì)胞胚胎發(fā)生類受體激酶(Somatic embryogenesis receptor-like kinases),參與多個(gè)植物信號途徑,且與無融合生殖、生物脅迫和非生物脅迫相關(guān)。SERK蛋白家族氨基酸序列高度同源,但功能具有特異性,其分子機(jī)理尚不清楚。SERK基因是無融合重要相關(guān)基因,蒲公英屬植物是研究無融合生殖的良好材料,但在蒲公英中未見有SERK家族基因相關(guān)的報(bào)道。SERK基因在蒲公英中可能參與哪些途徑,是未知的。因此本研究主要從無融合生殖蒲公英中克隆獲得SERK家族基因,通過生物信息學(xué)方法確定SERK家族基因的身份,并采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法對無融合生殖蒲公英SERK家族基因在不同組織中、鹽處理及白粉病菌處理下進(jìn)行表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)蒲公英SERK家族在蒲公英中可能參與的信號途徑,可為研究蒲公英中SERK基因家族提供基礎(chǔ)。本研究同時(shí)通過無縫連接法構(gòu)建Da SERK3B過表達(dá)載體,以GV3101農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法在無激素培養(yǎng)基上進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,為蒲公英中SERK家族基因的功能驗(yàn)證提供材料基礎(chǔ)。得到結(jié)果如下:1.從蒲公英屬植物中克隆得到4個(gè)SERK家族基因,其ORF長度分別1884bp、1923bp、1842bp、1872bp,經(jīng)氨基酸序列比對,分別命名為Da SERK1、Da SERK2、Da SERK3A、Da SERK3B。較前人的SERK家族基因進(jìn)化分析,增加了近幾年報(bào)道的SERK家族基因及本研究中克隆得到的基因,綜合來自不同物種中的49個(gè)SERK基因進(jìn)一步研究SERK基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。2.成功構(gòu)建了35S::Da SERK3B::GFP過表達(dá)載體,采用GV3101農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,經(jīng)PCR鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株。采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法對陽性植株進(jìn)行Da SERK3B基因相對表達(dá)量分析,轉(zhuǎn)基因植株Da SERK3B表達(dá)量明顯高于野生型及陰性對照,成功獲得過表達(dá)Da SERK3B轉(zhuǎn)基因植株。亞細(xì)胞定位及結(jié)構(gòu)域分析表明,Da SERK3B在細(xì)胞膜上表達(dá)。3.采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法,對不同組織、在NaCl處理和白粉病處理下的蒲公英材料進(jìn)行表達(dá)分析。組織特異性分析中,Da SERK1和Da SERK2在花中表達(dá)量較其他組織表達(dá)量高,差異極顯著。Da SERK3A和Da SERK3B在根中的表達(dá)量明顯高于其他組織中的表達(dá)量。蒲公英中SERK家族基因?qū)ι锩{迫和非生物脅迫有響應(yīng)。在白粉病菌處理下,白粉病感染程度增加,Da SERK1和Da SERK2表達(dá)量均增加;而Da SERK3A和表達(dá)量呈下降趨勢。
【圖文】：

技術(shù)路線Fig.1RouteofTechnic

圖 2.丹東蒲公英葉 RNA 瓊脂糖電泳f total RNA extracted from Leaf of Taraxacum a RNA；28s、18s 和 5s 為提取的總 RNA 中的 rRNA 大小。M：依次為 2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp,100 bp。到的 cDNA 為模板，分別以 DaSERK1、上下游引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。取 5 μL 樣小。DaSERK1、 DaSERK2、DaSERK3A、下圖 3。通過膠回收、連接與轉(zhuǎn)化、陽性克隆菌株送去金唯智公司測序。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S567.239

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本文編號：2644027