【摘要】：目的:Caveolin-3(CAV3)蛋白特異性表達(dá)在各類肌細(xì)胞膜上,但它在肌細(xì)胞中的生理功能尚未清楚。骨骼肌消耗全身大多數(shù)的葡萄糖為能源物質(zhì)來維持細(xì)胞的正常代謝及功能,位于細(xì)胞膜上的CAV3可能促進(jìn)了與葡萄糖代謝和細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖密切相關(guān)的Akt信號(hào)通路的敏感性。此外,CAV3基因編碼區(qū)變異P104L導(dǎo)致一種常染色體顯性遺傳疾病—1C型肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良(Limb-girdle muscular dystrophy-1C,LGMD-1C)。我們前期報(bào)告了當(dāng)P104L突變基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞時(shí),在胰島素刺激下,細(xì)胞葡萄糖攝取和糖原合成均下降。本研究觀察在不依賴胰島素刺激的情況下,分別轉(zhuǎn)染CAV3基因及其P104L突變型是否影響C2C12細(xì)胞糖代謝及其生長(zhǎng)增殖。方法:建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CAV3基因和CAV3-P104L的C2C12細(xì)胞系,通過生化、Western bolt和激光共聚焦顯微鏡方法,觀察在不使用胰島素刺激下CAV3基因及其突變蛋白對(duì)細(xì)胞糖代謝、生長(zhǎng)和增殖的影響,并探討CAV3和P104L突變蛋白對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響。結(jié)果:1.利用脂質(zhì)體建立穩(wěn)定CAV3及其突變基因型P104L的細(xì)胞系;2.C2C12細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)CAV3基因使CAV3表達(dá)增多,GLUT4蛋白總量不變,但細(xì)胞膜上CAV3和GLUT4蛋白均增加。葡萄糖攝取增加,糖原合成無明顯增加,但細(xì)胞表面積和細(xì)胞增殖加速。作為Akt信號(hào)傳導(dǎo)的下游分子與細(xì)胞增殖相關(guān)的p-p70s6K顯著增加,但是Akt信號(hào)傳導(dǎo)的另一個(gè)下游分子與糖原合成相關(guān)的GSK3β蛋白水平?jīng)]有改變;3.C2C12細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)CAV3的P104L突變基因可使CAV3蛋白的表達(dá)減少,CAV3和GLUT4蛋白細(xì)胞膜上的定位減少,抑制了細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和糖原的合成。突變?cè)斐杉?xì)胞形態(tài)顯著減小,但細(xì)胞增殖速度加快。Akt磷酸化被抑制,其下游分子GLUT4、p-GSK3β、p-p70s6K均顯著降低。結(jié)論:1.轉(zhuǎn)基因CAV3使蛋白表達(dá)升高可激活肌細(xì)胞Akt信號(hào),使GLUT4蛋白在細(xì)胞膜定位增加,促進(jìn)肌細(xì)胞攝取葡萄糖,加快細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖速率。2.CAV3-P104L突變基因通過減少CAV3的蛋白表達(dá)和細(xì)胞膜定位,抑制肌細(xì)胞的糖代謝及生長(zhǎng),卻加速細(xì)胞增殖,這些可能是LGMD-1C的發(fā)病機(jī)制。
【圖文】：

1：DNALadder；2：空載體；6：P104L extraction by electrophoresis. 1: DNA Laddesmids.B

表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R596.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2638324