【摘要】：抗黏液病毒(Myxovirus resistance,Mx)基因是在干擾素(Interferon,IFN)誘導(dǎo)下產(chǎn)生的具有抗病毒活性的因子,在生物界廣泛存在。Mx基因編碼的蛋白,其抗病毒作用的發(fā)揮與其典型的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。在魚類中,也存在多種Mx基因,并在魚類天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮著不同程度的抗病毒作用。因此,本研究利用RACE技術(shù)克隆了赤眼鱒Mx基因亞型(ScMx1),并利用熒光定量PCR技術(shù),對(duì)ScMx1和ScIFN-I在GCRV感染條件下的表達(dá)特征進(jìn)行了探究。此外,使用本團(tuán)隊(duì)劉敏構(gòu)建的含赤眼鱒Mx基因(ScMx)的重組質(zhì)粒ScMxORF-pTgf2-L-R,結(jié)合Tgf2高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng),在草魚中初步開展了轉(zhuǎn)基因研究。本研究獲得的主要結(jié)果如下:(1)ScMx1基因的cDNA克隆及序列分析結(jié)果ScMx1的cDNA全長(zhǎng)為3 000bp,包括5′非編碼區(qū)124 bp,3′非編碼區(qū)983 bp,開放閱讀框?yàn)? 893 bp,編碼630個(gè)氨基酸。ScMx1基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)具有脊椎動(dòng)物Mx蛋白的共同特征,在N端的GTP酶結(jié)構(gòu)域(含一個(gè)三聯(lián)體GTP結(jié)合區(qū)域和一個(gè)動(dòng)力蛋白信號(hào)),中間結(jié)構(gòu)域和C端的GTP酶效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(含亮氨酸拉鏈區(qū)域)。ScMx1與其他物種的相似性比較發(fā)現(xiàn),ScMx1與青魚bcMx1、草魚CiMx1和CiMx3的相似性較高,分別為97%、95%和97%;而ScMx1與ScMx、CiMx2、鯽魚Mx2等魚類的相似性較低,只有49%~50%。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹表明,ScMx1與bcMx、CiMx3、CiMx1等鯉科魚類進(jìn)化關(guān)系較近,與ScMx、CiMx2等鯉科魚類進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。為進(jìn)一步研究ScMx1以及ScMx的抗病毒功能奠定了理論基礎(chǔ)。(2)ScMx1基因的表達(dá)分析結(jié)果ScMx1在赤眼鱒鰓、肝臟、脾臟、體腎、頭腎、腦、皮膚、肌肉、腸和心臟共10個(gè)組織中均能夠檢測(cè)到,其中,ScMx1在脾臟中的表達(dá)量最高,其次是心臟,在腸和肝臟中的表達(dá)量相對(duì)較低。人工感染GCRV后(6 h,12 h,24 h,72 h,168 h),ScMx1與ScIFN-I在所檢測(cè)的肝臟、脾臟、體腎和頭腎4個(gè)組織中的表達(dá)量與對(duì)照組相比,均顯著上調(diào);但不同的組織,ScMx基因和ScIFN-I基因具有不同的表達(dá)特征。在肝臟和體腎中,ScMx1持續(xù)上調(diào)至168 h,而ScIFN-I在72h時(shí)達(dá)到峰值。在脾臟和頭腎中,ScMx1和ScIFN-I均在72 h時(shí)出現(xiàn)峰值�？傊�,ScMx1基因參與了赤眼鱒抵抗GCRV的免疫應(yīng)答反應(yīng)。(3)轉(zhuǎn)ScMx基因在草魚中的初步研究結(jié)果采用顯微注射法將重組質(zhì)粒ScMxORF-pTgf2-L-R和輔助質(zhì)粒pCS2-CMV-gfTP導(dǎo)入草魚受精卵中,共注射約6 000粒卵;經(jīng)過胚胎培養(yǎng)6個(gè)月,統(tǒng)計(jì)得到6月齡的轉(zhuǎn)基因草魚共206尾,計(jì)算存活率為3.4%。進(jìn)一步對(duì)存活的全樣本進(jìn)行PCR檢測(cè),得到陽(yáng)性整合率為37.9%,最終篩選出一批轉(zhuǎn)ScMx基因草魚陽(yáng)性群體。為轉(zhuǎn)基因草魚的抗病育種工作奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2638877