【摘要】：目的:Polo樣激酶1(polo-like kinase 1,PLK1)在人類腫瘤中過度表達(dá),我們前期實驗也發(fā)現(xiàn)PLK1基因在EBV轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞LCLs中高表達(dá)。本實驗采用CCK-8實驗和Hoechst染色觀察干擾PLK1基因表達(dá)后Raji細(xì)胞的增殖和凋亡情況,并通過熒光定量PCR和Western blot檢測穩(wěn)定低表達(dá)PLK1基因的Raji細(xì)胞中EB病毒基因的表達(dá)情況,進(jìn)一步研究EB病毒與宿主細(xì)胞的相互作用。方法:培養(yǎng)穩(wěn)定低表達(dá)PLK1基因的Raji細(xì)胞,倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光情況,采用CCK-8實驗和Hoechst染色觀察干擾PLK1基因表達(dá)后Raji細(xì)胞的增殖和凋亡情況,通過q RT-PCR技術(shù)驗證PLK1干擾效果。采用q RT-PCR和Western Blot檢測穩(wěn)定低表達(dá)PLK1基因的Raji細(xì)胞中EBV基因的表達(dá)情況。結(jié)果:1.培養(yǎng)穩(wěn)定低表達(dá)PLK1基因的Raji細(xì)胞。通過倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染組(Raji/PLK1 sh RNA和Raji/NC)細(xì)胞,攜帶綠色熒光的細(xì)胞數(shù)達(dá)70%;實時熒光定量PCR檢測表明干擾組(Raji/PLK1 sh RNA)與無意義sh RNA載體對照組(Raji/NC)和空白組(Raji)相比,PLK1基因在m RNA水平的表達(dá)均明顯降低,表明穩(wěn)定低表達(dá)PLK1基因的Raji細(xì)胞系干擾效果良好。2.干擾PLK1基因表達(dá)可抑制Raji細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡CCK-8結(jié)果顯示:干擾組Raji/PLK1 sh RNA細(xì)胞的生長速度明顯低于Raji/NC細(xì)胞和Raji細(xì)胞(P0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示干擾Raji細(xì)胞中PLK1基因的表達(dá)可抑制Raji細(xì)胞生長。Hoechst染色結(jié)果顯示:細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33342/PI雙染后涂片,鏡下發(fā)現(xiàn)Raji細(xì)胞和Raji/NC細(xì)胞呈弱藍(lán)色熒光+少量紅色熒光,而Raji/PLK1 sh RNA細(xì)胞呈強(qiáng)藍(lán)色熒光+少量紅色熒光,Raji/PLK1sh RNA細(xì)胞組中凋亡細(xì)胞明顯多于Raji細(xì)胞和Raji/NC細(xì)胞組,提示干擾Raji細(xì)胞中PLK1基因的表達(dá)可誘導(dǎo)Raji細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。3.干擾PLK1基因的表達(dá)可影響EBV基因的表達(dá)本研究采用熒光定量PCR和Western blot方法檢測干擾Raji細(xì)胞中PLK1基因表達(dá)前后,EB病毒潛伏基因的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)抑制PLK1基因表達(dá),可上調(diào)EB病毒基因LMP-1、LMP-2A和EBNA-1,而LMP-2B、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C和EBNALP基因表達(dá)未發(fā)現(xiàn)有明顯差異。結(jié)論:干擾Raji細(xì)胞中PLK1基因的表達(dá)可抑制Raji細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并上調(diào)EB病毒基因LMP-1、LMP-2A和EBNA-1的表達(dá)。
【圖文】：

第 3 章 結(jié)果3.1 熒光顯微鏡觀察結(jié)果首先培養(yǎng) Raji/PLK1 shRNA、Raji/NC 和 Raji 細(xì)胞，各取一瓶處于生長對數(shù)期且無污染的細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。如圖 3.1 所示，未做任何處理的 Raji 細(xì)胞無任何熒光信號，而轉(zhuǎn)染組 Raji/PLK1 shRNA 和 Raji/NC 細(xì)胞可見強(qiáng)綠色熒光，且同一視野下與白光細(xì)胞圖片相比攜帶綠色熒光的細(xì)胞數(shù)達(dá) 70%以上，，提示轉(zhuǎn)染有效。

為 GAPDH 和 PLK1 基因的擴(kuò)增曲線及融解曲線。圖 3.4 為 RaLK1 shRNA 三組細(xì)胞 2-ΔΔCt值的統(tǒng)計分析圖。Raji/PLK1 shRN因在 mRNA 水平的表達(dá)明顯低于 Raji/NC 細(xì)胞及 Raji 細(xì)胞，計學(xué)意義，表明轉(zhuǎn)染 pLenR-GPH-hPLK1-sh 質(zhì)粒的 Raji 細(xì)胞中NA 水平的表達(dá)明顯下降，可進(jìn)行后續(xù)實驗。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R733.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2638035