【摘要】：在世界范圍內(nèi),口腔癌約占全世界惡性腫瘤的3%,口腔癌中以舌癌最常見(jiàn)。雖然科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展使醫(yī)療水平不斷提升,舌癌的治療手段也因此得到不斷改善,但患者的五年生存率仍然不高,術(shù)后的生存質(zhì)量也不盡如意。因此,從分子水平研究舌癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,以期望實(shí)現(xiàn)舌癌的分子靶向治療、提高患者生存質(zhì)量和預(yù)后成為研究的熱門(mén)。本課題組前期通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-10、MMP-13在舌癌組織中相對(duì)高表達(dá),與舌癌密切相關(guān)。因此,本課題擬通過(guò)研究抑制MMP-10、MMP-13基因后舌癌細(xì)胞CAL-27增殖、侵襲、遷移能力的變化,進(jìn)一步明確它們?cè)谏喟┲邪l(fā)揮的作用,并探討其可能的機(jī)制,為舌癌的治療提供新思路。目的研究抑制MMP-10、MMP-13對(duì)舌癌細(xì)胞CAL-27增殖、侵襲遷移能力的影響,為舌癌基因靶向治療提供理論基礎(chǔ)和臨床依據(jù)。方法第一部分:篩選及進(jìn)一步驗(yàn)證舌癌癌及癌旁組織差異基因。由上海眾信生物技術(shù)有限公司通過(guò)對(duì)5對(duì)舌癌患者的癌組織和癌旁組織進(jìn)行基于NGS的RNAseq測(cè)序,初步篩選出部分差異基因MMPs;將收集的舌癌及癌旁組織標(biāo)本應(yīng)用q RT-PCR方法對(duì)差異基因MMPs進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。第二部分:探討抑制MMP-10、MMP-13基因?qū)ι喟┘?xì)胞株CAL-27生物學(xué)行為的影響。用針對(duì)MMP-10和MMP-13基因序列分別設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的si RNA,轉(zhuǎn)染CAL-27細(xì)胞,通過(guò)Realtime PCR技術(shù)檢測(cè)兩個(gè)基因在RNA水平的表達(dá)變化,篩選出兩條干擾效果較好的si RNA;采用蛋白免疫印跡法(Western blot)驗(yàn)證兩個(gè)基因在蛋白水平的表達(dá)變化。運(yùn)用CCK8法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)研究MMP-10、MMP-13被干擾后CAL-27細(xì)胞增殖能力的改變;采用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)及侵襲小室法研究MMP-10、MMP-13被干擾后CAL-27細(xì)胞遷移、侵襲能力的改變。第三部分:建立動(dòng)物模型觀察抑制舌癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MMP-10表達(dá)后癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的改變。構(gòu)建靶向抑制MMPs基因的慢病毒載體,感染舌癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株,建立裸鼠舌部原位癌模型,觀察及計(jì)算各組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。結(jié)果第一部分:RNA-seq測(cè)序結(jié)果顯示5對(duì)癌組織中MMP-10、MMP-13相對(duì)高表達(dá),應(yīng)用q RT-PCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證也發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因在大部分舌癌組織中相對(duì)高表達(dá)。第二部分:si RNA-MMP-10/si RNA-MMP-13轉(zhuǎn)染CAL-27細(xì)胞后,Real-time PCR及Western blot結(jié)果顯示相應(yīng)的MMP-10/MMP-13在RNA水平及蛋白水平表達(dá)下調(diào);CCK8法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示si RNA-MMP-13轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力明顯低于陰性對(duì)照組;劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、侵襲小室結(jié)果表明,MMP-10/MMP-13表達(dá)下降后CAL-27細(xì)胞的遷移、侵襲能力也隨之下降。第三部分:慢病毒抑制穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組1336組MMP-10蛋白較NC組表達(dá)下調(diào),遷移能力較NC組降低,我們選擇1336組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞和NC組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1336組裸鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較NC組下降。結(jié)論MMP-10、MMP-13在癌組織中相對(duì)高表達(dá);抑制MMP-13基因后CAL-27細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力均減弱;抑制MMP-10基因后CAL-27細(xì)胞的遷移、侵襲能力均減弱;MMP-10、MMP-13基因可能對(duì)人舌鱗癌的增殖、遷移和侵襲起到一定的促進(jìn)作用。
【圖文】：

結(jié) 果 舌癌及癌旁組織收集情況收集 52 例舌癌及癌旁組織來(lái)自福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院行舌癌切除術(shù)的新鮮織標(biāo)本，每例包癌及癌旁組織，置于已經(jīng)標(biāo)記好的凍存管中，并迅速置于-80°冰箱儲(chǔ)存，用于組織 RNA 的提取。 RNA-seq 測(cè)序結(jié)果上海眾信生物技術(shù)有限公司對(duì) 5 對(duì)舌癌患者的癌組織和癌旁組織進(jìn)行 RNA-seq序，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)應(yīng)的癌旁組織相比，MMP-10、MMP-13 在舌癌組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)，其在癌與癌旁組織中的表達(dá)量均數(shù)比值分別為 319.8334 和9.0876。

表 1.5 所示為其中一次一對(duì)舌癌及癌旁組織 RNA 提取的濃度和純度，表 1.5所示 RNA 的濃度和純度，純度均在 1.80 以上，表明所提取的 RNA 達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，，可以用于逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。表 1.5 RNA 濃度及純度處理組 濃度（μg/μl） OD260/OD280Tumor 0.5824 1.91Normal 0.6426 1.943.2 Real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果用 qRT-PCR 測(cè)定 52 對(duì)舌癌組織及癌旁組織中 MMPP-10、MMP-13 的相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算ΔCt，作圖 1.2，如圖所示，MMP-10、MMP-13 在舌癌組織中的表達(dá)量高于癌旁組織 (P<0.0001，)，其中 90%（47/52）的舌癌組織中 MMP-10的表達(dá)量高于旁癌組織，88%（46/52）的舌癌組織中 MMP-13 的表達(dá)量高于旁癌組織。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R739.86

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2637979