【摘要】：綠僵菌作為一種雙防真菌可以同時用于植物病害防治和植物蟲害防治的絲狀真菌。作為一種絲狀真菌,綠僵菌主要包括有典型的兩種不同生活史時期——分生孢子和菌絲體。此外,近年來,綠僵菌在昆蟲病原真菌的遺傳調(diào)節(jié)機制、致病機制及生物防治方面,被作為一種病原真菌的模式生物來研究。泛素(ubiquitin)一種76個氨基酸殘基的高度保守的熱穩(wěn)定的小分子蛋白質(zhì),是調(diào)節(jié)生物體蛋白質(zhì)的降解重要控制基因。在動植物以及絲狀真菌中,多聚泛素(Polyubiquitin)是由不同數(shù)目的76個氨基酸殘基串聯(lián)在一起,組成的高保守的小分子蛋白質(zhì),多聚泛素主要通過泛素途徑選擇性的降解受損蛋白,參與干旱、高溫、高鹽、和重金屬多種逆境應(yīng)答。本研究以羅伯茨綠僵菌Metarhizium robertsii為研究對象;首先,對綠僵菌polyubiquitin基因--MrUBI4進行了生物信息學(xué);其次,基于同源重組的原理,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù),獲得MrUBI4的基因敲除菌株(△MrUBI4)和回補菌株(△MrUBI4::MrUBI4);最后,通過比較敲除突變菌株(MT)與野生型菌株(WT)、回補突變菌株(Comp)在生長發(fā)育、抗逆、產(chǎn)孢量和毒力等方面的差異,從而明確MrUBI4的具體生物學(xué)功能。具體研究結(jié)果如下:1.本實驗分析得到多聚泛素基因,并進行blast序列分析得到系統(tǒng)發(fā)育樹和綠僵菌泛素化通路中蛋白分析。2.通過基因敲除技術(shù)獲得了綠僵菌MrUBI4基因敲除菌株和回補菌株;3.進行性狀分析,發(fā)現(xiàn)MT的孢子有明顯畸形變化,生長速率和產(chǎn)孢量都有下降;在抗外界環(huán)境壓力下,MT孢子萌發(fā)率明顯降低;在抗化學(xué)壓力下和侵染大蠟螟能力無明顯變化。綜上所述,MrUBI4基因敲除株的孢子形態(tài)產(chǎn)生畸形,菌落生長速率減弱,孢子產(chǎn)孢量減少,孢子抗紫外和熱脅迫能力下降;這些結(jié)果說明MrUBI4對綠僵菌的生長發(fā)育和抗環(huán)境壓力具有重要作用。
【圖文】：

系統(tǒng)發(fā)育樹

3.2.2 敲除株和回補株的獲得與驗證將 WT，MT，Comp 3 種菌株分別接種到 SDAY 培養(yǎng)基平板上，分別提取 DNA并分別使用 bar 基因、MrUBI4 基因和 ben 基因，，在分子水平驗證 3 種菌株與該基因大小一致。將測序后的序列與 NCBI 上登錄的菌株序列比對，完全一致。將 WT，MT分別提取 total RNA，并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 使用 MrUBI4 基因上游下游與 bar 基因組成的新的引物，在 RNA 分子水平驗證 2 種菌株與該基因大小一致，分別陽性送樣測序?qū)y序后的序列與 NCBI 上登錄的菌株序列比對，完全一致。
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S476.12

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本文編號：2633877