【摘要】：原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),作為肝癌惡性腫瘤的一類(lèi),是我國(guó)發(fā)生率高且危害極大的惡性腫瘤之一。研究表明,肝內(nèi)轉(zhuǎn)移是肝癌的首要轉(zhuǎn)移位點(diǎn),也是肝癌致死的首要原因。目前對(duì)肝癌細(xì)胞的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移過(guò)程雖有所了解,但是研究尚不深入,尚無(wú)有效治療靶點(diǎn)和藥物阻斷肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移過(guò)程。因此需要進(jìn)一步明確肝癌細(xì)胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵分子及其作用機(jī)制。除了自身抑癌或促癌基因的改變外,細(xì)胞與他們賴(lài)以生存的微環(huán)境之間的相互作用對(duì)于正常組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)以及腫瘤組織的生長(zhǎng)都是至關(guān)重要的。特別是腫瘤細(xì)胞與相關(guān)間質(zhì)之間的相互作用形成了一個(gè)強(qiáng)大的關(guān)系網(wǎng),可影響腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟、多因素參與的過(guò)程,包括原發(fā)腫瘤的形成、原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞的局部侵襲,腫瘤細(xì)胞內(nèi)滲入血管和淋巴管,在血管和淋巴管中的生存,外滲出血管和淋巴管,在遠(yuǎn)端定植灶的存活。腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中,腫瘤的微環(huán)境發(fā)揮了重要的作用,其中包括腫瘤低氧環(huán)境、腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞等。任何腫瘤轉(zhuǎn)移的最終結(jié)局都是在遠(yuǎn)端定植灶上形成新的腫瘤,腫瘤是如何在遠(yuǎn)端定植灶的存活和再生這個(gè)問(wèn)題一直是科學(xué)家想攻克的難題。為了研究腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程的最終階段-在遠(yuǎn)端定植灶的存活,篩選出能夠高定植的細(xì)胞顯得尤為重要。為了研究肝癌轉(zhuǎn)移過(guò)程的最終階段-在遠(yuǎn)端定植灶的存活,我們構(gòu)建了脾臟注射-肝定植(轉(zhuǎn)移)模型,利用該模型我們篩選獲得了一系列的高定植(轉(zhuǎn)移)能力的肝癌細(xì)胞株。利用表達(dá)譜芯片檢測(cè),根據(jù)P值0.05,差異倍數(shù)≥5倍,我們篩選到64條在高定植細(xì)胞中差異表達(dá)的mRNA。進(jìn)一步在更多的高定植細(xì)胞中驗(yàn)證,以確保在除了芯片中的兩株細(xì)胞以外至少還有另外兩株高定植細(xì)胞表達(dá)符合差異基因的表達(dá)結(jié)果,以此我們篩選到31條基因,其中上調(diào)表達(dá)基因17條、下調(diào)表達(dá)基因14條。根據(jù)與肝癌臨床病人預(yù)后之間的關(guān)系,最終我們篩選到SLC38A4、GJA1在高定植細(xì)胞株中普遍存在差異表達(dá),在多個(gè)隊(duì)列的肝癌組織樣本中也存在差異表達(dá),并且與肝癌病人的高復(fù)發(fā)率、差的預(yù)后相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)SLC38A4不僅在肝癌組織樣本中下調(diào)表達(dá)并且隨著肝癌的進(jìn)展表達(dá)量逐漸降低,在肝臟發(fā)育過(guò)程中還呈現(xiàn)逐漸上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì),且與肝癌病人的預(yù)后呈正相關(guān),即肝癌病人SLC38A4含量越高,病人的預(yù)后情況越好。我們又對(duì)SLC38A4的臨床預(yù)后進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)SLC38A4的表達(dá)情況與肝癌病人的腫瘤大小、TNM分期、BCLC分期、腫瘤轉(zhuǎn)移以及血清AFP含量相關(guān)。隨后進(jìn)行了SLC38A4的生物學(xué)功能研究,干性球形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾SLC38A4增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的干性能力;CCK8、乙炔脫氧尿甘結(jié)合染色(EDU)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞周期檢測(cè)證實(shí)干擾SLC38A4促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖;劃痕實(shí)驗(yàn)以及transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾SLC38A4可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲;裸鼠體內(nèi)皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾SLC38A4促進(jìn)腫瘤的增殖。上述結(jié)果證明SLC38A4為抑癌基因,干擾SLC38A4在體內(nèi)體外條件下都可以促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。Western blot結(jié)果顯示干擾SLC38A4可以增加ERK和AKT磷酸化水平,表明干擾SLC38A4可以使腫瘤中的MAPK信號(hào)通路及PI3K/AKT信號(hào)通路活化,促進(jìn)肝癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。我們對(duì)GJA1進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)GJA1在高定植細(xì)胞中普遍高表達(dá),在多個(gè)隊(duì)列的肝癌組織中也是高表達(dá),并且與肝癌病人的高復(fù)發(fā)率、差的預(yù)后呈正相關(guān)。裸鼠脾臟注射-肝定植體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),GJA1能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的肝內(nèi)定植能力。我們對(duì)過(guò)表達(dá)GJA1的細(xì)胞進(jìn)行了體外功能學(xué)實(shí)驗(yàn),CCK8、克隆形成、EDU檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化,transwell實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲能力,我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)GJA1對(duì)細(xì)胞本身的增殖能力、遷移侵襲能力沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響。為了探究高定植肝癌細(xì)胞株高定植的原因,我們對(duì)高定植肝癌細(xì)胞株進(jìn)行裸鼠皮下荷瘤,發(fā)現(xiàn)體內(nèi)情況下高定植細(xì)胞株所形成的腫瘤增殖更快,有更強(qiáng)的血管形成能力。我們將過(guò)表達(dá)GJA1的細(xì)胞進(jìn)行裸鼠皮下荷瘤,CD31、CD34染色顯示過(guò)表達(dá)GJA1細(xì)胞形成的皮下荷瘤有更高的血管密度。為了探究GJA1對(duì)血管形成的影響,我們用過(guò)表達(dá)GJA1細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞的條件培養(yǎng)基刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)發(fā)現(xiàn)小管形成并無(wú)差異性改變。由于GJA1可以使兩種細(xì)胞之間形成縫隙連接(gap junction),使其相互之間傳遞物質(zhì),我們猜測(cè)過(guò)表達(dá)GJA1的細(xì)胞可能和HUVEC通過(guò)直接接觸后形成縫隙連接促進(jìn)小管的形成,于是我們將過(guò)表達(dá)GJA1及對(duì)照的肝癌細(xì)胞與HUVEC進(jìn)行共培養(yǎng),我們檢測(cè)到過(guò)表達(dá)GJA1細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞與HUVEC共培養(yǎng)后形成小管能力增強(qiáng)。綜上所述,我們對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的最終環(huán)節(jié)-在定植灶中的存活進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)在肝癌轉(zhuǎn)移晚期即在定植灶的存活階段時(shí),腫瘤細(xì)胞中的基因SLC38A4以及GJA1在其中發(fā)揮了重要的作用。該項(xiàng)研究為進(jìn)一步理解肝癌轉(zhuǎn)移進(jìn)程中腫瘤本身因素及微環(huán)境因素發(fā)揮的作用提供了新鮮的思路和視角,為肝癌的轉(zhuǎn)移提供了潛在預(yù)防及診療靶點(diǎn)。
【圖文】：

圖 1-1. 高定植肝癌細(xì)胞株的篩選方法及驗(yàn)證Figure1-1．Screening methods and validation of highly colonization hepatocellularcarcinoma cell lines.(A) A Schematic Model of screening of highly colonization hepatocellular carcinomacells.

圖 1-2. 高定植細(xì)胞株芯片結(jié)果分析Figure 1-2．The analysis of microarray data about the highly colonization cells.Heat map representation of microarray data about the expression levels of genes inhepa1-6 cells and highly colonization cells P6-3, P11-1.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2633645