【摘要】：粘蟲Mythimna separata隸屬于昆蟲綱(Insecta)鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae),是一種典型的季節(jié)性遠距離遷飛害蟲,主要危害玉米、小麥和水稻三大糧食作物。除西藏和新疆外,我國各地均有粘蟲災害發(fā)生。遷飛是導致粘蟲大范圍爆發(fā)的主要原因。經(jīng)變態(tài)發(fā)育重建的器官在昆蟲遷飛中具有重要作用,如復眼和翅膀,這些器官的發(fā)生受多種基因的調(diào)控。已有研究表明,Pax6基因通過編碼轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控果蠅和蟾蜍的細胞增殖、分化與器官的形成。該基因是否調(diào)控粘蟲胚后發(fā)育中器官的重建是值得深究的。本實驗根據(jù)候選基因法則,以粘蟲為研究對象,探究Pax6基因在其胚后發(fā)育中的作用,旨在為研究粘蟲變態(tài)發(fā)育和遷飛行為的分子機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),同時也為農(nóng)業(yè)害蟲的生物防治提供了新思路。本研究主要通過RT-PCR技術(shù)克隆了粘蟲Pax6基因部分片段,建立了該基因在粘蟲不同發(fā)育時期的表達模式,最后通過RNA干擾技術(shù)對Pax6基因進行沉默,驗證了Pax6基因在胚后發(fā)育中的作用。(1)克隆獲得長699bp的Pax6基因片段,編碼233個氨基酸殘基。同源性分析表明,其與棉鈴蟲Pax6基因同源性高達88%,其次為斜紋夜蛾85%,小菜蛾83%。(2)以EF-1α為內(nèi)參基因,結(jié)合實時熒光定量PCR技術(shù),分析了粘蟲不同發(fā)育時期Pax6基因表達量的差異,結(jié)果表明,Pax6基因在蛹期第2天和第3天的表達量比羽化前其他時期的表達量高。羽化后第一天,表達量迅速升高,顯著高于其他時期。(3)利用RNA干擾技術(shù),驗證Pax6基因的功能。將合成的Pax6-dsRNA注射入6齡末期粘蟲體內(nèi),不同時間取材,測定目的基因mRNA表達量的變化。結(jié)果表明,注射后第1、2、3天,處理組(注射Pax6-dsRNA組)的表達量明顯低于對照組(注射GFP-dsRNA和注射DEPC水),說明RNA干擾有效地抑制了Pax6基因的表達。對RNA干擾后的粘蟲蛹及成蟲表型觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),33%的幼蟲化蛹后頭殼不能正常蛻去,待羽化后口器發(fā)育畸形,不能伸縮;42%的蛹腹部未能形成堅硬的外殼,羽化后翅膀嚴重褶皺,并影響飛行能力。因此,推斷Pax6基因可能與變態(tài)發(fā)育中多種器官的重建有關(guān)。
【圖文】：

本研究的技術(shù)路線

圖 2-1 pMD-18T 載體的結(jié)構(gòu)圖具體步驟為：（1）連接。連接的反應體系為：PMD 18-T Vector 1 μLddH2O 3 μLLigation solution 1 5 μLInsert DNA 1 μL將體系充分混勻后，短暫離心，放于 4℃過夜（16 個小時）。（2）轉(zhuǎn)化。① 接冰，，將感受態(tài)細胞冰浴融化（不可放于室溫融化）。② 將 10 μL（1）中的連接產(chǎn)物加到 200 μL 的感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，并在冰
【學位授予單位】：山西師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S433.4

【參考文獻】

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本文編號：2632967