【摘要】：大豆作為人們生活中重要的油料作物之一,時時刻刻影響著農(nóng)業(yè)發(fā)展。植物油脂越來越被人們重視,提高大豆種子油脂含量也變得越來越重要。本研究以大豆籽�？寺〉玫降腉mWRI1全長cDNA序列為前提,將已經(jīng)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBASTA-GmWRI1利用Floral Dip法浸染轉(zhuǎn)化缺失wri基因的突變體擬南芥突變體,獲得多種轉(zhuǎn)基因擬南芥回補(bǔ)植株,并對野生型擬南芥、超表達(dá)擬南芥、擬南芥突變體和回補(bǔ)的擬南芥進(jìn)行種子油脂含量的分析來驗(yàn)證GmWRI1基因的功能;利用農(nóng)桿菌注射法侵染轉(zhuǎn)化煙草研究GmWRI1的細(xì)胞定位功能;利用CRISPR/cas9系統(tǒng)構(gòu)建GmWRI1基因的敲除載體,并將CRISPR-GmWRI1和pBASTA-GmWRI1兩種載體利用大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法分別侵染轉(zhuǎn)化大豆,獲得超表達(dá)大豆和基因敲除大豆。研究結(jié)論如下:1.將植物表達(dá)載體pBASTA-GmWRI1利用Floral Dip法轉(zhuǎn)化缺失wri基因的擬南芥突變體,獲得擬南芥回補(bǔ)植株。并通過索氏抽提法和實(shí)時熒光定量PCR分別對野生型擬南芥、超表達(dá)擬南芥、擬南芥突變體和回補(bǔ)的擬南芥進(jìn)行種子油脂含量分析和定量分析。結(jié)果顯示,超表達(dá)擬南芥與野生型擬南芥相比種子油脂含量提高了2.52%,擬南芥突變體與野生型擬南芥相比種子油脂含量下降4.06%,回補(bǔ)的擬南芥與野生型擬南芥種子油脂含量相比下降1.74%。結(jié)果初步證實(shí)GmWRI1基因?qū)μ岣叻N子油脂含量有促進(jìn)作用,并對基因缺失導(dǎo)致的低油種子的油脂含量有一定的回補(bǔ)作用,通過油脂含量和基因表達(dá)量的結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)擬南芥種子中的油脂含量和GmWRI1基因的表達(dá)量可能是正相關(guān)。2.成功構(gòu)建了瞬時表達(dá)載體pCAMBIA1302-GmWRI1,并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105,利用農(nóng)桿菌注射法注射煙草葉片觀察GmWRI1的亞細(xì)胞定位功能,結(jié)果表明,GmWRI1基因定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜中。3.利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建植物表達(dá)載體CRISPR-GmWRI1并轉(zhuǎn)入具有侵染植物作用的農(nóng)桿菌EHA105中,通過大豆子葉節(jié)穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化法將超表達(dá)載體和基因敲除載體分別轉(zhuǎn)入大豆中,并獲得5株T_1代超表達(dá)轉(zhuǎn)基因大豆,6株T_0代基因敲除轉(zhuǎn)基因大豆。
【圖文】：

圖 2.1 擬南芥種子成熟過程中油脂合成調(diào)控的過程[77]Figure 2.1 Regulation of oil synthesis during seed maturation in Arabidopsis thaliana于轉(zhuǎn)錄因子 GmWRI1 與下游調(diào)控基因所結(jié)合的順式作用元件在其他植物是通過 AW-BOX 來相互作用。實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)通過酵母單雜體系統(tǒng)進(jìn)行GmWRI1 作為 AP2/EREBP 轉(zhuǎn)錄激活因子可以與 AW-box 順式作用元件發(fā)互作用，從而控制大豆下游基因的表達(dá)。據(jù) GenBank 上公布的大豆丙酮酸激酶（GmPK）基因的全長序列，查詢 G動子序列，并應(yīng)用 http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htm子序列，尋找大豆轉(zhuǎn)錄因子 GmWRI1 的結(jié)合位點(diǎn) AW-BOX 順式作nG](n)7[CG]）。Floral Dip 法浸染轉(zhuǎn)化擬南芥用 Floral Dip 法浸染轉(zhuǎn)化擬南芥的基本流程：石和土壤按照 7：3 比例混合均勻裝在滅土的布袋中，進(jìn)行 121℃高壓蒸已滅菌的土裝入培養(yǎng)缽里，潤濕土壤。發(fā)育正常的已經(jīng)干燥的突變體擬南芥種子放在 1.5mL 離心管中，加入適

圖 3.1 花后 35 天的大豆種子總 RNAM：DL 2000 Marker；1-7：大豆種子總 RNAre 3.1 Total RNA of soybean seeds 35 days after flow：DL 2000 Marker；1-7：Total RNA from oybean s后 35 天的 cDNA 為模板擴(kuò)增得到目的基因體 pEASY-T1，然后將質(zhì)粒 pEASY-T1-GmW）中，，對 T 載體進(jìn)行酶切驗(yàn)證（圖 3.3），
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S565.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2632836