發(fā)布時(shí)間：2020-04-18 22:39

【摘要】：植物暴露于不利環(huán)境中,會(huì)遭受各種形式的脅迫包括非生物脅迫如干旱,鹽度和低溫,以及由病原體和害蟲攻擊引起的生物脅迫。這些逆境脅迫會(huì)直接影響植物,尤其是農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì),導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕收。為了適應(yīng)千變?nèi)f化的環(huán)境,植物通過長期的進(jìn)化,形成了一套復(fù)雜的防衛(wèi)逆境脅迫系統(tǒng)。植物識(shí)別各種脅迫信號(hào),并通過加工處理,激活相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,最終誘導(dǎo)大量植物防衛(wèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),從而保護(hù)植物免受脅迫的影響。植物多聚半乳糖醛酸抑制蛋白(PGIP)是一種能夠特異性識(shí)別和結(jié)合真菌多聚半乳糖醛酸酶(PG)的結(jié)構(gòu)蛋白,其富含亮氨酸重復(fù)(LRR)結(jié)構(gòu),在植物抗真菌病害中起重要作用。本研究比較實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組篩選結(jié)果,利用PCR克隆得到了一個(gè)玉米PGIP蛋白基因,通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因具有LRR結(jié)構(gòu)域,并且存在疏水性N端信號(hào)肽結(jié)構(gòu)和保守的半胱氨酸殘基對(duì),初步認(rèn)為是玉米PGIP家族基因。進(jìn)化樹分析表明該基因與其他物種PGIP親緣關(guān)系較近,且與水稻OsPGIP1基因高度同源,確定其為玉米PGIP家族基因,命名為ZmPGIP3。亞細(xì)胞定位顯示ZmPGIP3基因位于細(xì)胞膜或細(xì)胞壁中,熒光定量PCR顯示ZmPGIP3基因在玉米根、莖、葉、雄蕊、雌蕊、種子中均有表達(dá),并且在根中表達(dá)量最高。脅迫處理后發(fā)現(xiàn)ZmPGIP3受到脅迫損傷處理的極顯著誘導(dǎo),同時(shí)植物激素茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)能顯著誘導(dǎo)ZmPGIP3的表達(dá),推測ZmPGIP3基因可能與抗病相關(guān),并且很有可能通過JA或SA路徑參與植物抗病調(diào)控。為進(jìn)一步驗(yàn)證ZmPGIP3的基因功能,構(gòu)建了 ZmPGIP3表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ZmPGIP3轉(zhuǎn)入水稻之中,使其在水稻中過表達(dá),通過PCR進(jìn)行了陽性鑒定和純系鑒定,共檢測獲得了 7個(gè)T3代純系。熒光定量PCR表明ZmPGIP3在7個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中均有很高的表達(dá)量,表明ZmPGIP3已經(jīng)整合到水稻基因組中,且能夠轉(zhuǎn)錄。利用隨機(jī)篩選出的純系植株,我們對(duì)ZmPGIP3的抗病功能進(jìn)行分析,在接種水稻紋枯病的初步研究中顯示,轉(zhuǎn)入ZmPGIP3基因的水稻具有較好的水稻紋枯病抗性。在接種紋枯病菌7天后,野生型對(duì)照植株受到了紋枯病害的脅迫,莖干上出現(xiàn)典型的水稻紋枯病菌斑,并且隨著感染時(shí)間的增加,病斑開始擴(kuò)散并且數(shù)量也增多;但轉(zhuǎn)基因水稻的3個(gè)純系植株在接種的第7天僅僅輕微遭受病菌影響,并沒有出現(xiàn)病斑的情況,在第15天才出現(xiàn)明顯病斑情況。因此初步認(rèn)為ZmPGIP3能夠增強(qiáng)水稻抗紋枯病能力。為分析轉(zhuǎn)基因水稻的可能抗病機(jī)制,測定了轉(zhuǎn)基因植株中脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。熒光定量PCR結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)ZmPGIP3基因水稻中抗病防御基因PR3、PR8、PR10和OsPAL的表達(dá)被誘導(dǎo),同時(shí)轉(zhuǎn)基因水稻中JA合成基因AOC和AOS的表達(dá)也被誘導(dǎo)。上述結(jié)果表明ZmPGIP3可能通過JA路徑來調(diào)控水稻抗紋枯病抗性,為今后進(jìn)一步研究其功能機(jī)制做準(zhǔn)備,也為分子育種提供了基因資源。
【圖文】：

圖２．３邋ＺｍＰＧ／ＰＪ在煙草細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位逡逑其中（ａ）和（ｄ）分別是ｓｍ：邋ＧＦＰ、ＺｍＰＩＦ３：邋ｓｍＧＦＰ在熒光下的視野；（ｂ）和（ｅ）分別是ｓｍ：邋ＧＦＰ、逡逑ＺｍＰＩＦ３：邋ｓｍＧＦＰ在白光下的視野；（ｃ）和（ｆ）分別是ｓｍ：邋ＧＦＰ、ＺｍＰＩＢ：邋ｓｍＧＦＰ的疊加視野

ＰＧｓ能夠與平板底物中的多聚半乳糖醛酸發(fā)生酶解反應(yīng)，產(chǎn)生單糖，ＨＣＬ與酶解區(qū)域逡逑結(jié)合可見擴(kuò)散圈，擴(kuò)散圈圈的大小與ＰＧｓ活性呈正相關(guān)，與ＺｍＰＧＩＰ３的抑制作用呈負(fù)相逡逑關(guān)，因此我們通過瓊脂糖平板法測定了邋ＺｍＰＧＩＰ３的活性，結(jié)果如圖２．４所示：每個(gè)孔中均逡逑能發(fā)現(xiàn)不同大小的擴(kuò)散圈，加入ＺｍＰＧＩＰ３的孔周圍的擴(kuò)散圈明顯小于另外兩個(gè)對(duì)照，同逡逑時(shí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果也證明ＺｍＰＧＩＰ３顯著減少了邋ＰＧｓ的活性，防止了擴(kuò)散圈的變大，說明ＺｍＰＧＩＰ３逡逑抑制了邋ＰＧｓ的活性。逡逑ＰＧｓ＋ＺｍＰＧＩＰ３邋Ｉ邋！邐§邋１５邐女邋＊＊逡逑ｃ邐邐邋＂Ｔ￣＂逡逑□邐｜１0－邐逡逑｜逡逑＾０－５－逡逑ＰＧｓ邋［】邐｜邋0．0－Ｊ？＿，＿Ｉ＿Ｉ＿，＿Ｉ＿Ｉ＿＿，＿＿Ｌ逡逑ＡＢＣ逡逑圖２．４瓊脂平板法測定ＰＧｓ－ＺｍＰＧＩＰ３活性結(jié)果逡逑其中Ａ代表ＰＧｓ＋ＺｍＰＧｌＰ３處理；Ｂ代表ＰＧｓ＋磷酸鹽緩沖液處理；Ｃ代表ＰＧｓ單獨(dú)處理。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ｔｈｅ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ＺｍＰＧＩＰ３邋ａｇａｉｎｓｔ邋ＰＧｓ．邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ邋ａｓｓａｙ邋ｏｆ邋ＰＧｓ，邋Ａ：逡逑ＰＧｓ＋ＺｍＰＧＩＰ３；邋Ｂ：邋ＰＧｓ＋Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｂｕｆｆｅｒ；邋Ｃ：邋ＰＧｓ逡逑３．４邋ＺｍＰＧ／／＾基因表達(dá)分析逡逑３．４．１邋ＺｗＰＧP基因組織特異性表達(dá)分析逡逑提取正常生長的玉米植株的根、莖、葉、雄蕊、雌蕊和幼嫩籽粒的總ＲＮＡ，反轉(zhuǎn)錄合逡逑成ｃＤＮＡ，，采用ＲＴ－ＰＣＲ的方法對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行檢測，以玉米Ａｃｔｉｎ基因作為內(nèi)參基逡逑因
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.111.42

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本文編號(hào)：2632616