發(fā)布時間：2020-04-18 13:27

【摘要】：目的:利用CRISPR/Cas9技術(shù),針對HGPRT目的基因設(shè)計打靶sgRNA,進行基因敲除并通過篩選單克隆技術(shù)等從而獲得HGPRT基因缺陷型細胞株,為制備兔抗單克隆抗體打下良好基礎(chǔ)。方法:利用GenBank找出HGPRT基因組的外顯子區(qū)域。利用在線網(wǎng)站,輸入第一個和最長的外顯子序列作為靶序列,設(shè)計sgRNA,選出并篩選最優(yōu)序列。構(gòu)建CRISPER/Cas9重組真核質(zhì)粒,利用慢病毒包裝技術(shù),通過293T細胞包裝得到靶向兔HGPRT基因的病毒株。再利用構(gòu)建的重組質(zhì)粒包裝獲得的慢病毒侵染兔骨髓瘤細胞,通過藥物Puromycin、6-TG和HAT選擇培養(yǎng)基篩選,有限稀釋法單克隆技術(shù),獲得的中靶陽性細胞克隆—HGPRT基因缺陷型的兔骨髓瘤細胞。結(jié)果:1、設(shè)計相對應(yīng)的sgRNA,通過測序的方法驗證了成功構(gòu)建具有兔HGPRT基因敲除序列的CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒。2、利用重組質(zhì)粒lentiCRISPR v2,包裝輔助質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G三種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后,包裝出具有基因敲除能力的慢病毒株。3、通過用濃縮的重組慢病毒侵染生長狀況較好的對數(shù)生長期兔骨髓瘤細胞,分別用0.8μg/mL的Puromycin,梯度濃度的6-TG(6-疏基鳥嘌呤)進行加藥篩選后再通過HAT選擇培養(yǎng)基進行驗證。通過有限稀釋單克隆法分離得出中靶陽性單克隆細胞。4、將實驗組的細胞擴培后提取DNA進行T7E1酶切驗證,以及直接測序兩種方法鑒定,成功篩選到HGPRT基因缺陷型單克隆細胞。結(jié)論:本課題通過CRISPER/Cas9技術(shù),成功構(gòu)建靶向敲除兔HGPRT基因的lentiCRISPR v2重組質(zhì)粒,并包裝濃縮出具有敲除HGPRT基因的慢病毒株,通過侵染后一系列的篩選和驗證手段,建立了兔骨髓瘤HGPRT基因缺陷型細胞。該基因改造缺陷型細胞,為后續(xù)的兔抗單克隆細胞雜交實驗打下了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖１－２邋ＺＦＮｓ對靶ＤＮＡ序列的識別和切割（Ｍｉｌｌｅｒ邋ａｎｄ邋Ｈｏｌｍｅｓ，２００７）設(shè)計的左右ＺＦＮｓ相互作用，使ＦｏＫＩ在結(jié)鋅指構(gòu)域?qū)Γ模危岭p鏈進行切割；的三維模型逡逑２類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（ＴＡＬＥＮｓ）逡逑．１邋定義逡逑轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ邋ｅｆｆｅｃｔｏｒ邋ｎｕｃｌＥＮ）于１９８９年從植物病原菌黃單胞菌屬（Ｘａｎ－ｔｈｏｍｏｎａｓ）中分離出來［６１由兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，一個是行使精準切割作用的ＦｏＫＩ酶結(jié)構(gòu)域，另ＬＥＮ蛋白特異性結(jié)合的ＤＮＡ結(jié)構(gòu)域。由于ＴＡＬＥＮ蛋白中的ＤＮＡ較為固定，是由高度重復(fù)的氨基酸組合成１２－３０個高保守重復(fù)的Ｎ的特異性ＤＮＡ識別就是依靠這些重復(fù)單元上的氨基酸［６２，６３］，因此ＴＡＬＥＮ的核心區(qū)域。在這些重復(fù)單元中有兩個較為特殊的氨基酸被

Ｌ＾ｌ邋ＪＩＦＰ邐ｃｓｏｍａｉｉｆｉ逡逑圖１－２邋ＺＦＮｓ對靶ＤＮＡ序列的識別和切割（Ｍｉｌｌｅｒ邋ａｎｄ邋Ｈｏｌｍｅｓ，２００７）逡逑ａ）人工設(shè)計的左右ＺＦＮｓ相互作用，使ＦｏＫＩ在結(jié)鋅指構(gòu)域?qū)Γ模危岭p鏈進行切割；ｂ）圖形逡逑的三維模型逡逑１．４．２類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（ＴＡＬＥＮｓ）逡逑１．４．２．１邋定義逡逑轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ邋ｅｆｆｅｃｔｏｒ邋ｎｕｃｌｅａｓｅ，，逡逑ＴＡＬＥＮ）于１９８９年從植物病原菌黃單胞菌屬（Ｘａｎ－ｔｈｏｍｏｎａｓ）中分離出來［６１］。該逡逑酶主要由兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，一個是行使精準切割作用的ＦｏＫＩ酶結(jié)構(gòu)域，另一個逡逑是ＴＡＬＥＮ蛋白特異性結(jié)合的ＤＮＡ結(jié)構(gòu)域。由于ＴＡＬＥＮ蛋白中的ＤＮＡ識別逡逑結(jié)構(gòu)域較為固定，是由高度重復(fù)的氨基酸組合成１２－３０個高保守重復(fù)的單元。逡逑ＴＡＬＥＮ的特異性ＤＮＡ識別就是依靠這些重復(fù)單元上的氨基酸［６２，６３］，因此它們逡逑就是ＴＡＬＥＮ的核心區(qū)域。在這些重復(fù)單元中有兩個較為特殊的氨基酸被稱為逡逑可變雙殘基（ＲＶＤ，Ｒｅｐｅａｔ－Ｖａｒｉａｂｌｅ邋Ｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅｓ）［６４１。因為在這些保守的高重復(fù)單逡逑元中，只有這兩個位于１２和１３的氨基酸是可以改變的。并且這個重復(fù)序列可逡逑變的雙殘基與四個堿基相對應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：福州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q78

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李增剛,周海濤,李福才,富偉能,邱廣蓉,王捷,孫開來;氟嗎啉誘發(fā)V79和CHL細胞基因突變和染色體畸變的研究[J];衛(wèi)生毒理學(xué)雜志;2004年03期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 李世佳;利用CRISPR技術(shù)敲除兔細胞HGPRT基因[D];福州大學(xué);2018年

2 李增剛;氟嗎啉誘導(dǎo)V79和CHL細胞基因突變和染色體畸變研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2003年

3 涂宏剛;喹喔啉類藥物對哺乳動物細胞的遺傳毒性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

本文編號：2632142