發(fā)布時(shí)間：2020-04-18 11:20

【摘要】：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶pepc基因是C_4途徑中的關(guān)鍵酶基因。為探究pepc基因?qū)_3植物擬南芥光合特性的影響,本實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)玉米C_4型pepc基因擬南芥和野生型擬南芥為材料,對(duì)17個(gè)T_3代純合pepc轉(zhuǎn)基因擬南芥株系進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)pepc基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)及表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。在現(xiàn)蕾期對(duì)pepc轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和野生型植株相應(yīng)光合酶活性、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒狻艄夂纤俾实壬砩卣鬟M(jìn)行檢測(cè)。并在干旱脅迫條件下測(cè)定pepc轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗氧化酶活性、可溶性蛋白、可溶性糖等生理特性。對(duì)玉米C_4光合途徑關(guān)鍵酶基因pepc基因?qū)_3植物擬南芥光合特性影響效應(yīng)進(jìn)行了研究,主要研究結(jié)果如下:(1)對(duì)T_2代轉(zhuǎn)pepc基因擬南芥轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行篩選,獲得17個(gè)高表達(dá)T_3代純合pepc轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。(2)對(duì)17個(gè)高表達(dá)T_3代純合pepc轉(zhuǎn)基因擬南芥株系進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果顯示pepc基因已成功轉(zhuǎn)入擬南芥基因組中,分別提取T_3代純合pepc轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和野生型擬南芥植株的RNA,反轉(zhuǎn)錄生成cDNA進(jìn)行RT-PCR,pepc轉(zhuǎn)基因擬南芥植株和陽(yáng)性質(zhì)粒DNA都能擴(kuò)增出200bp的目的條帶。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)pepc基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定,PC2、PC3、PC5、PC7、PC15、PC16、PC18株系的pepc基因相對(duì)表達(dá)量較PC17分別高13.60、12.23、11.57、10.34、2.20、3.70、6.34倍,達(dá)到顯著水平。(3)在現(xiàn)蕾期對(duì)17個(gè)高表達(dá)T_3代純合pepc轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和野生型植株進(jìn)行生理生化特征檢測(cè),pepc轉(zhuǎn)基因株系PC2、PC3、PC5、PC9轉(zhuǎn)基因株系的PEPC平均酶活性分別為552.16、438.48、389.76、194.88U/g,較野生型擬南芥植株分別提高了34、27、24、12倍;PC2、PC3、PC5、PC11、PC12、PC13、PC18轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素含量較野生型擬南芥植株分別提高了53.17%、57.56%、44.88%、42.44%、49.27%、45.61%、47.07%;pepc轉(zhuǎn)基因株系PC2、PC3、PC5、PC9、PC11、PC12株系的Rubisco平均酶活性較野生型擬南芥植株分別提高了24.07%、23.77%、24.27%、22.09%、22.33%、24%;PC2、PC3、PC5、PC7、PC9、PC11、PC12、PC13、PC18轉(zhuǎn)基因株系的凈光合速率較野生型擬南芥植株分別提高了51.85%、43.82%、41.41%、41.58%、36.77%、37.96%、38.97%、36.28%、34.08%,增幅達(dá)到顯著水平。(4)探究了干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)pepc基因擬南生理特性的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在干旱脅迫處理下,所有株系的SOD、POD、CAT抗氧化酶活性較正常條件下均有所提高;在干旱脅迫下PC1、PC2、PC4、PC8、PC12、PC13轉(zhuǎn)基因株系的SOD酶活性為5.57、5.39、5.26、4.47、4.96、4.11U/mg(pro),SOD酶活性上升明顯;PC1、PC2、PC4、PC8、PC12、PC13轉(zhuǎn)基因株系的POD酶活性為12.7、12.84、11.89、10.54、10.32、9.88KU/mg(pro)/h,pepc轉(zhuǎn)基因株系在干旱脅迫處理下POD酶活性均有提高,其中PC1顯著高于其他轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。在正常條件和干旱處理下pepc轉(zhuǎn)基因株系SOD酶活性都高于野生型擬南芥植株;PC1、PC2、PC4、PC8、PC12、PC13轉(zhuǎn)基因株系在干旱脅迫條件下的CAT酶活性為1.41、1.38、1.34、1.27、1.25、1.19KU/mg(pro)/h,pepc轉(zhuǎn)基因株系在干旱脅迫處理下CAT酶活性均有提高,其中PC1顯著高于其他轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。在正常條件和干旱處理下pepc轉(zhuǎn)基因株系CAT酶活性都高于野生型擬南芥植株。T_3代純合pepc轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的可溶性糖和可溶性蛋白與野生型沒有顯著性差異,其丙二醛含量有所降低。(5)通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將攜帶玉米C_4光合途徑關(guān)鍵酶基因pepc的表達(dá)載體(pEXPR-PEPC)導(dǎo)入NC89型煙草幼嫩葉片中,經(jīng)過愈傷組織和生根誘導(dǎo)獲得再生植株,再生植株經(jīng)過PCR和RT-PCR分子生物學(xué)鑒定結(jié)果呈陽(yáng)性,初步判斷,pepc基因已導(dǎo)入NC89型煙草植株中,并在煙草中表達(dá)。
【圖文】：

圖 2-1pepc 全長(zhǎng)基因表達(dá)載體構(gòu)建示意圖 2-1 Schematic diagram of the construction of PEPC full length gene expression vector驗(yàn)方法高表達(dá)的 T3代純合 pepc 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的篩選1）配 500 mL 0.1 %的瓊脂糖，高溫高壓滅菌 20 min，冷卻至果凍狀備2）將收獲的 T1代種子放入 50 mL 離心管中，加入適量 0.1 %的瓊脂糖入 4 ℃冰箱春化 2-3 d；3）將春化后的種子混合液用移液槍吸取，均勻滴至營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上（丹麥1），放入光照培養(yǎng)箱進(jìn)行正常培養(yǎng)；4）待長(zhǎng)出 4 片真葉的幼苗先用 10000 倍 Basta 溶液均勻噴灑植株葉片再用 5000 倍 Basta 溶液噴灑兩遍；

第二章 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的初步表2.3.2 T3 代純合 pepc 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株 PCR 電泳結(jié)果與分析提取 T3代純合 pepc 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的葉片總 DNA、野生型擬南芥葉和攜帶有 pepc 基因的大腸桿菌質(zhì)粒 DNA，，根據(jù)含酶切位點(diǎn)的 pepc 全長(zhǎng)目的測(cè)引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳圖如下：
【學(xué)位授予單位】：河南科技學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2

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本文編號(hào)：2632044