【摘要】：背景和目的生長抑素是一種肽類激素,由胃腸道黏膜的D細胞分泌,廣泛存在于胃腸道粘膜,其中以胃竇和胃體部含量最高。有研究表明生長抑素在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在一定的抑制作用,也有學者發(fā)現不同濃度的SST可以刺激胃癌細胞的生長,因此,SST與胃癌的發(fā)生發(fā)展的關系及其作用機制和途徑尚未明確。SST作為廣泛分布在胃粘膜上的一種多肽類激素,可以抑制胃泌素的分泌從而誘導慢性萎縮性胃炎的發(fā)生,慢性萎縮性胃炎是胃癌發(fā)生的癌前疾病和病理基礎。SEM5A和KLF2作為胃癌的潛在驅動基因,可能與SST在早期胃癌的發(fā)生發(fā)展存在著某種調控作用。過去對SST基因于胃癌的研究只局限與進行基因干擾或基因沉默,并未對SST基因進行真正意義上的敲除。尚未有文獻報道SST發(fā)揮作用是否與胃癌驅動基因有關,因此我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對胃癌細胞的SST基因進行定點敲除,觀察SST在胃癌發(fā)生過程中的作用和對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲等方面的影響,以及對胃癌驅動基因SEM5A和KLF2表達的影響,探討SST是否通過調控胃癌驅動基因SEM5A和KLF2發(fā)揮抑制作用。方法1.針對SST基因靶位點設計sgRNA,在靶位點的上下游部位各設計一對sgRNA進行雙切,根據sgRNA的位置設計reporter序列。序列合成后與載體px330和pmcherry EGFP進行酶切連接,構建重組載體px330-SST-sgRNA、pmcherry EGFP-SST-reporter,利用HEK293T細胞初步篩選出切割效率比較高的sgRNA。2.將重組載體轉染到目的細胞BGC823,進行流式分選,培養(yǎng)獲得單克隆細胞株。根據靶位點設計PCR引物,提取目的細胞基因組PCR后進行序列測定,鑒定單克隆細胞SST基因是否敲除成功。檢測獲得的目的細胞中是否有SST蛋白表達。3.敲除SST基因對胃癌細胞BGC823增殖、遷移和侵襲能力的影響。利用MTT實驗檢測細胞的增殖能力;Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力;劃痕實驗檢測細胞的遷移能力。4.敲除SST對胃癌驅動基因SEM5A和KLF2蛋白表達的影響。通過Western blotting和免疫細胞熒光檢測SEM5A和KLF2的蛋白表達。結果1.成功構建載體px330-SST-sgRNA和pmcherry EGFP-SST-reporter,獲得SST基因敲除的單克隆細胞株1E9。2.細胞的形態(tài)發(fā)生了變化,1E9細胞邊界模糊,出現較多觸角。細胞1E9的增殖能力增強,遷移和侵襲能力同時也增強。3.1E9細胞中胃癌驅動基因SEM5A和KLF2的蛋白表達量增強。結論SST在胃癌細胞BGC823的增殖、遷移和侵襲過程中發(fā)揮抑制作用,SST可能通過調控胃癌驅動基因SEM5A和KLF2抑制胃癌細胞的發(fā)生發(fā)展。
【圖文】：

px330質粒圖譜

pmcherryEGFP-reporter示意圖
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2

【參考文獻】

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1 Sara Massironi;Alessandra Zilli;Dario Conte;;Somatostatin analogs for gastric carcinoids:for many, but not all[J];World Journal of Gastroenterology;2015年22期

2 ;Correlation between expression of gastrin, somatostatin and cell apoptosis regulation gene bcl-2/bax in large intestine carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2005年05期

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1 顧嫣s，

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