【摘要】：背景和目的生長(zhǎng)抑素是一種肽類激素,由胃腸道黏膜的D細(xì)胞分泌,廣泛存在于胃腸道粘膜,其中以胃竇和胃體部含量最高。有研究表明生長(zhǎng)抑素在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在一定的抑制作用,也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)不同濃度的SST可以刺激胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng),因此,SST與胃癌的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其作用機(jī)制和途徑尚未明確。SST作為廣泛分布在胃粘膜上的一種多肽類激素,可以抑制胃泌素的分泌從而誘導(dǎo)慢性萎縮性胃炎的發(fā)生,慢性萎縮性胃炎是胃癌發(fā)生的癌前疾病和病理基礎(chǔ)。SEM5A和KLF2作為胃癌的潛在驅(qū)動(dòng)基因,可能與SST在早期胃癌的發(fā)生發(fā)展存在著某種調(diào)控作用。過(guò)去對(duì)SST基因于胃癌的研究只局限與進(jìn)行基因干擾或基因沉默,并未對(duì)SST基因進(jìn)行真正意義上的敲除。尚未有文獻(xiàn)報(bào)道SST發(fā)揮作用是否與胃癌驅(qū)動(dòng)基因有關(guān),因此我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)胃癌細(xì)胞的SST基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除,觀察SST在胃癌發(fā)生過(guò)程中的作用和對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等方面的影響,以及對(duì)胃癌驅(qū)動(dòng)基因SEM5A和KLF2表達(dá)的影響,探討SST是否通過(guò)調(diào)控胃癌驅(qū)動(dòng)基因SEM5A和KLF2發(fā)揮抑制作用。方法1.針對(duì)SST基因靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)sgRNA,在靶位點(diǎn)的上下游部位各設(shè)計(jì)一對(duì)sgRNA進(jìn)行雙切,根據(jù)sgRNA的位置設(shè)計(jì)reporter序列。序列合成后與載體px330和pmcherry EGFP進(jìn)行酶切連接,構(gòu)建重組載體px330-SST-sgRNA、pmcherry EGFP-SST-reporter,利用HEK293T細(xì)胞初步篩選出切割效率比較高的sgRNA。2.將重組載體轉(zhuǎn)染到目的細(xì)胞BGC823,進(jìn)行流式分選,培養(yǎng)獲得單克隆細(xì)胞株。根據(jù)靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR引物,提取目的細(xì)胞基因組PCR后進(jìn)行序列測(cè)定,鑒定單克隆細(xì)胞SST基因是否敲除成功。檢測(cè)獲得的目的細(xì)胞中是否有SST蛋白表達(dá)。3.敲除SST基因?qū)ξ赴┘?xì)胞BGC823增殖、遷移和侵襲能力的影響。利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。4.敲除SST對(duì)胃癌驅(qū)動(dòng)基因SEM5A和KLF2蛋白表達(dá)的影響。通過(guò)Western blotting和免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)SEM5A和KLF2的蛋白表達(dá)。結(jié)果1.成功構(gòu)建載體px330-SST-sgRNA和pmcherry EGFP-SST-reporter,獲得SST基因敲除的單克隆細(xì)胞株1E9。2.細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了變化,1E9細(xì)胞邊界模糊,出現(xiàn)較多觸角。細(xì)胞1E9的增殖能力增強(qiáng),遷移和侵襲能力同時(shí)也增強(qiáng)。3.1E9細(xì)胞中胃癌驅(qū)動(dòng)基因SEM5A和KLF2的蛋白表達(dá)量增強(qiáng)。結(jié)論SST在胃癌細(xì)胞BGC823的增殖、遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮抑制作用,SST可能通過(guò)調(diào)控胃癌驅(qū)動(dòng)基因SEM5A和KLF2抑制胃癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。
【圖文】：

px330質(zhì)粒圖譜

pmcherryEGFP-reporter示意圖
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 Sara Massironi;Alessandra Zilli;Dario Conte;;Somatostatin analogs for gastric carcinoids:for many, but not all[J];World Journal of Gastroenterology;2015年22期

2 ;Correlation between expression of gastrin, somatostatin and cell apoptosis regulation gene bcl-2/bax in large intestine carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2005年05期

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1 顧嫣s，

本文編號(hào)：2631942