【摘要】：葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,EC 1.1.3.4),簡稱GOD,是一種需氧脫氫酶,在氧氣存在時它能專一有效地將β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸從而有效地將去除氧氣,已發(fā)展為一種重要的工業(yè)酶制劑,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、發(fā)酵、化工、生物等領(lǐng)域。葡萄糖氧化酶主要存在于多種動物、植物、真菌和細菌中,但動植物中GOD含量少且有一定的局限性,而細菌產(chǎn)生的GOD量也較少,難以達到理想產(chǎn)量。目前工業(yè)上最主要的GOD生產(chǎn)菌株是黑曲霉和青霉,但黑曲霉和青霉生產(chǎn)GOD產(chǎn)量較低、且提取和純化工藝繁雜,因此利用基因工程手段構(gòu)建更加優(yōu)良高產(chǎn)的GOD生產(chǎn)菌株一直是科研工作者們努力研究的方向。為獲得高產(chǎn)量、高活性的葡萄糖氧化酶表達菌株,我們根據(jù)畢赤酵母中密碼子的偏愛性對已有報導的GOD雙突變基因T132S/T56V進行DNA序列的密碼子優(yōu)化,并且在優(yōu)化的基因序列前端引入45 bp的信號肽序列h_2-factor,通過人工基因合成的方法得到一個經(jīng)過優(yōu)化的葡萄糖氧化酶基因序列,命名為GOD-M,并將其克隆到表達載體pGAPk上,構(gòu)建成為畢赤酵母重組表達質(zhì)粒pGAPk-h_2-GOD-M。利用電擊轉(zhuǎn)化的方法將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,利用GOD的酶學特性篩選酵母轉(zhuǎn)化子,并驗證到GOD基因的成功表達。為了找到能夠得到更加高效的GOD表達載體,我們從啟動子入手在重組載體pGAPk-h_2-GOD-M的基礎(chǔ)上做以下改造:1.將質(zhì)粒pGAPk-h_2-GOD-M的啟動子pGAP替換成pGCW14,得到重組載體pGCW14k-h_2-GOD-M,編號G1;2.將質(zhì)粒pGAPk-h_2-GOD-M的啟動子pGAP替換成pAOX1,得到重組載體pAOX1k-h_2-GOD-M,編號A1;3.對質(zhì)粒pGCW14k-h_2-GOD-M的啟動子pGCW14進行定點改造,得到2種啟動子發(fā)生了突變的重組載體,編號為MG1和MG2;4.對質(zhì)粒pAOX1k-h_2-GOD-M的啟動子pAOX1進行部分序列的改造,得到3種不同啟動子的重組載體,分別編號為MA1、MA2和MA3;5.對啟動子pGCW14和pAOX1的5’非編碼序列(5’UTR)進行彼此互換,得到的重組啟動子分別編號為GU_A和AU_G。以上所得表達載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,發(fā)酵培養(yǎng)測定發(fā)酵上清液的GOD酶活力,以此來比較各種啟動子啟動效率的強弱。通過酶活力測定,我們成功篩選到了能夠更加高效表達GOD的組成型啟動子pGCW14U_A和pGCW14G+20A/C-467T以及誘導型啟動子pAOX1-DL*,有望在畢赤酵母高效表達研究中具有一定的前景。
【圖文】：

西南大學碩士學位論文 載體構(gòu)建GAP 質(zhì)粒骨架大片段和 Kan 抗性基因片段擴增如如 3-2a 所示：通道 1 是 DN量標準；通道 2 和 3 分別是 PCR 產(chǎn)物 Kan 片段和 pGAP 質(zhì)粒骨架大片段，量大小與預期相符，擴增成功。pGAPk 和 pMV-h2-GOD 的酶切鑒定如圖 3：通道 1 是 DNA 分子量標準；通道 2 是 pMV-h2-GOD 質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物，有子量分別在 2200 bp 和 1700 bp 左右的條帶，與預期相符，其中 1700 bp 左帶為 h2-GOD 片段；通道 3 是 pMV-h2-GOD 質(zhì)粒，其表觀分子量小于實際值 bp；通道 4 是 pGAPk 質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物，與預期的 3217 bp 相符；通道 5 是 pGA，其表觀分子量也小于實際值 3323 bp。通道 3 和通道 5 兩個質(zhì)粒表觀分子際值偏小主要是因為其雙鏈環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)。 pGAPk-h2-GOD 重組轉(zhuǎn)化子篩選電泳如圖 3-2c 所示，圖中通道 M 為 DNA 分子量標準，1 、2、3、4、挑取的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，7 為 pMV-h2-GOD 質(zhì)粒。根據(jù)電泳結(jié)果選取分子量大小的 2、5 質(zhì)粒送三博測序鑒定，測序結(jié)果正確，說明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2-GOD轉(zhuǎn)化畢赤酵母，根據(jù)GOD基因是否在重組酵母中成功表達來驗證所構(gòu)建的GOD表達載體功能。酵母轉(zhuǎn)化篩選結(jié)果如圖3-4 ：平板上長出7個單菌落且都有GOD酶活力顯示，，表明GOD表達載體成功轉(zhuǎn)入了畢赤酵母并且實現(xiàn)了GOD在酵母中的表達，重組表達載體pGAPk-h2-GOD可以運用于后續(xù)畢赤酵母表達的研究中。圖 3-4 酵母轉(zhuǎn)化子篩選Fig. 3-4 Screening of Yeast transformation
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q786

【參考文獻】

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本文編號：2631848