【摘要】：葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,EC 1.1.3.4),簡(jiǎn)稱GOD,是一種需氧脫氫酶,在氧氣存在時(shí)它能專一有效地將β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸從而有效地將去除氧氣,已發(fā)展為一種重要的工業(yè)酶制劑,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、發(fā)酵、化工、生物等領(lǐng)域。葡萄糖氧化酶主要存在于多種動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌中,但動(dòng)植物中GOD含量少且有一定的局限性,而細(xì)菌產(chǎn)生的GOD量也較少,難以達(dá)到理想產(chǎn)量。目前工業(yè)上最主要的GOD生產(chǎn)菌株是黑曲霉和青霉,但黑曲霉和青霉生產(chǎn)GOD產(chǎn)量較低、且提取和純化工藝繁雜,因此利用基因工程手段構(gòu)建更加優(yōu)良高產(chǎn)的GOD生產(chǎn)菌株一直是科研工作者們努力研究的方向。為獲得高產(chǎn)量、高活性的葡萄糖氧化酶表達(dá)菌株,我們根據(jù)畢赤酵母中密碼子的偏愛(ài)性對(duì)已有報(bào)導(dǎo)的GOD雙突變基因T132S/T56V進(jìn)行DNA序列的密碼子優(yōu)化,并且在優(yōu)化的基因序列前端引入45 bp的信號(hào)肽序列h_2-factor,通過(guò)人工基因合成的方法得到一個(gè)經(jīng)過(guò)優(yōu)化的葡萄糖氧化酶基因序列,命名為GOD-M,并將其克隆到表達(dá)載體pGAPk上,構(gòu)建成為畢赤酵母重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPk-h_2-GOD-M。利用電擊轉(zhuǎn)化的方法將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,利用GOD的酶學(xué)特性篩選酵母轉(zhuǎn)化子,并驗(yàn)證到GOD基因的成功表達(dá)。為了找到能夠得到更加高效的GOD表達(dá)載體,我們從啟動(dòng)子入手在重組載體pGAPk-h_2-GOD-M的基礎(chǔ)上做以下改造:1.將質(zhì)粒pGAPk-h_2-GOD-M的啟動(dòng)子pGAP替換成pGCW14,得到重組載體pGCW14k-h_2-GOD-M,編號(hào)G1;2.將質(zhì)粒pGAPk-h_2-GOD-M的啟動(dòng)子pGAP替換成pAOX1,得到重組載體pAOX1k-h_2-GOD-M,編號(hào)A1;3.對(duì)質(zhì)粒pGCW14k-h_2-GOD-M的啟動(dòng)子pGCW14進(jìn)行定點(diǎn)改造,得到2種啟動(dòng)子發(fā)生了突變的重組載體,編號(hào)為MG1和MG2;4.對(duì)質(zhì)粒pAOX1k-h_2-GOD-M的啟動(dòng)子pAOX1進(jìn)行部分序列的改造,得到3種不同啟動(dòng)子的重組載體,分別編號(hào)為MA1、MA2和MA3;5.對(duì)啟動(dòng)子pGCW14和pAOX1的5’非編碼序列(5’UTR)進(jìn)行彼此互換,得到的重組啟動(dòng)子分別編號(hào)為GU_A和AU_G。以上所得表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,發(fā)酵培養(yǎng)測(cè)定發(fā)酵上清液的GOD酶活力,以此來(lái)比較各種啟動(dòng)子啟動(dòng)效率的強(qiáng)弱。通過(guò)酶活力測(cè)定,我們成功篩選到了能夠更加高效表達(dá)GOD的組成型啟動(dòng)子pGCW14U_A和pGCW14G+20A/C-467T以及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子pAOX1-DL*,有望在畢赤酵母高效表達(dá)研究中具有一定的前景。
【圖文】：

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文 載體構(gòu)建GAP 質(zhì)粒骨架大片段和 Kan 抗性基因片段擴(kuò)增如如 3-2a 所示：通道 1 是 DN量標(biāo)準(zhǔn)；通道 2 和 3 分別是 PCR 產(chǎn)物 Kan 片段和 pGAP 質(zhì)粒骨架大片段，量大小與預(yù)期相符，擴(kuò)增成功。pGAPk 和 pMV-h2-GOD 的酶切鑒定如圖 3：通道 1 是 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；通道 2 是 pMV-h2-GOD 質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物，有子量分別在 2200 bp 和 1700 bp 左右的條帶，與預(yù)期相符，其中 1700 bp 左帶為 h2-GOD 片段；通道 3 是 pMV-h2-GOD 質(zhì)粒，其表觀分子量小于實(shí)際值 bp；通道 4 是 pGAPk 質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物，與預(yù)期的 3217 bp 相符；通道 5 是 pGA，其表觀分子量也小于實(shí)際值 3323 bp。通道 3 和通道 5 兩個(gè)質(zhì)粒表觀分子際值偏小主要是因?yàn)槠潆p鏈環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)。 pGAPk-h2-GOD 重組轉(zhuǎn)化子篩選電泳如圖 3-2c 所示，圖中通道 M 為 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 、2、3、4、挑取的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，7 為 pMV-h2-GOD 質(zhì)粒。根據(jù)電泳結(jié)果選取分子量大小的 2、5 質(zhì)粒送三博測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果正確，說(shuō)明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2-GOD轉(zhuǎn)化畢赤酵母，根據(jù)GOD基因是否在重組酵母中成功表達(dá)來(lái)驗(yàn)證所構(gòu)建的GOD表達(dá)載體功能。酵母轉(zhuǎn)化篩選結(jié)果如圖3-4 ：平板上長(zhǎng)出7個(gè)單菌落且都有GOD酶活力顯示，，表明GOD表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入了畢赤酵母并且實(shí)現(xiàn)了GOD在酵母中的表達(dá)，重組表達(dá)載體pGAPk-h2-GOD可以運(yùn)用于后續(xù)畢赤酵母表達(dá)的研究中。圖 3-4 酵母轉(zhuǎn)化子篩選Fig. 3-4 Screening of Yeast transformation
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q786

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2631848