【摘要】：核糖體蛋白作為構(gòu)成核糖體的重要組分,通過(guò)維持核糖體的穩(wěn)定性、正常生物學(xué)功能來(lái)調(diào)控蛋白質(zhì)的合成進(jìn)而影響植物的各項(xiàng)生命活動(dòng)。擬南芥核糖體蛋白在進(jìn)化上是非常保守的,根據(jù)所處細(xì)胞位置不同分為胞質(zhì)核糖體蛋白、葉綠體核糖體蛋白以及線粒體核糖體蛋白。目前,已經(jīng)有一些研究對(duì)部分?jǐn)M南芥核糖體蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能進(jìn)行了闡述,但是擬南芥核糖體小亞基蛋白R(shí)PS9M在植物體內(nèi)行使什么樣的生物學(xué)功能還未見(jiàn)報(bào)道。因此,對(duì)RPS9M在擬南芥中的生物學(xué)功能進(jìn)行研究將有助于人們加深對(duì)核糖體蛋白功能的了解,深化核糖體蛋白對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。本文以雙受精關(guān)鍵調(diào)控因子ANK6為切入點(diǎn),通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)篩選擬南芥cDNA文庫(kù),鑒定到RPS9M蛋白,并以RPS9M T-DNA插入突變體以及CRISPR/Cas9敲除突變體為材料,利用生物化學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)該基因的功能進(jìn)行分析,取得了如下結(jié)果:首先,酵母雙雜交系統(tǒng)和雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)(BiFC)都證實(shí)RPS9M蛋白能夠與錨定蛋白ANK6相互作用,且相互作用發(fā)生在線粒體。RPS9M蛋白具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)功能域,分別是位于C端的核糖體蛋白S9結(jié)構(gòu)域和位于N端的非保守結(jié)構(gòu)域。酵母雙雜交顯示,RPS9M蛋白的C端結(jié)構(gòu)域主要參與與ANK6蛋白之間的直接互作,而N端結(jié)構(gòu)域可以調(diào)控C端結(jié)構(gòu)域互作的強(qiáng)弱。然后,對(duì)RPS9M蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了分析。結(jié)果清晰顯示RPS9M定位于線粒體,表明RPS9M為一個(gè)線粒體核糖體蛋白。接著,對(duì)RPS9M的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果表明RPS9M主要在生殖發(fā)育過(guò)程中有很高的表達(dá),且表達(dá)主要集中在胚囊以及花粉發(fā)育的各個(gè)時(shí)期以及受精后種子發(fā)育的前期階段。同時(shí)在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段也有一定量的表達(dá),表達(dá)主要集中在根尖、幼葉等生長(zhǎng)比較旺盛的部位。隨后,對(duì)RPS9M基因缺失突變體,rps9m-1和rps9m-2進(jìn)行表型分析發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)功能缺失突變體均無(wú)法獲得純合突變體,且角果內(nèi)有接近一半的種子出現(xiàn)敗育。正反交實(shí)驗(yàn)表明,RPS9M突變后雌配子體的傳遞效率只有3%左右,雄配子體的傳遞效率也受到嚴(yán)重的影響,只有21%作用。表明RPS9M在植物生殖發(fā)育過(guò)程中起著非常重要的作用;該基因突變后影響了雌、雄配子體的發(fā)育。緊接著對(duì)突變體花粉、胚囊的發(fā)育以及雙受精和胚發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了分析+/rps9m-1突變體有大約30%左右的花粉敗育,敗育的花粉呈現(xiàn)個(gè)體縮小,形態(tài)皺縮,無(wú)細(xì)胞核存在,表面紋飾不清晰,萌發(fā)溝不明顯等典型敗育表型。對(duì)雌配子體發(fā)育進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)突變體胚囊極核不能融合形成中央細(xì)胞核,中央細(xì)胞液泡發(fā)育緩慢,最終液泡體積比野生型小;說(shuō)明RPS9M缺失會(huì)影響極核的融合以及中央液泡的發(fā)育。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)突變的胚囊對(duì)雙受精過(guò)程中花粉管的吸引以及雌、雄配子的融合并無(wú)影響,但對(duì)隨后的胚和胚乳發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響。受精卵的發(fā)育基本停滯在合子或2細(xì)胞原胚階段;胚乳發(fā)育則停滯在2-4胚乳核階段,最終導(dǎo)致突變體種子敗育。且種子敗育的表型在授野生型花粉的條件下也無(wú)法恢復(fù),說(shuō)明種子敗育的表型由胚囊缺陷引起。另外,從GABI-KAT擬南芥突變體種子庫(kù)獲得了一個(gè)RPS9M基因敲減(knock-down)的純合突變體rps9m-3,RPS9M蛋白表達(dá)水平降低至正常水平的30%左右。對(duì)rps9m-3突變體進(jìn)行表型分析,突變體同樣具有花粉發(fā)育異常、胚囊發(fā)育缺陷等表型。大部分成熟花粉都具有3個(gè)細(xì)胞核,但花粉的形態(tài)出現(xiàn)畸形,且花粉在柱頭上的萌發(fā)以及花粉管的生長(zhǎng)均比野生型的緩慢。部分胚囊的發(fā)育也發(fā)生缺陷且表型比rps9m-1和rps9m-2胚囊的更嚴(yán)重。RPS9M突變后對(duì)胚和胚乳的發(fā)育以及胚形態(tài)建成過(guò)程中也產(chǎn)生影響。在種子發(fā)育過(guò)程中,rps9m-3突變體胚和胚乳的發(fā)育均比野生型緩慢,同一角果內(nèi)各胚胎發(fā)育的一致性也受到影響。部分rps9m-3突變體胚的形態(tài)建成異常,早期胚胎發(fā)育過(guò)程中頂細(xì)胞的異常分裂以及胚柄頂端細(xì)胞的縱向分裂導(dǎo)致胚表皮原細(xì)胞層與內(nèi)層細(xì)胞區(qū)分不明顯,胚基部異常增大,胚輻射對(duì)稱異常以及子葉原基的分裂異常最終導(dǎo)致子葉發(fā)育不完全或形成融合子葉或產(chǎn)生多片子葉。RPS9M突變對(duì)植株的生長(zhǎng)也產(chǎn)生一定的影響。在種子萌發(fā)階段,rps9m-3種子萌發(fā)比野生型緩慢且種子萌發(fā)率顯著低于野生型種子;種子萌發(fā)后rps9m-3根的生長(zhǎng)顯著慢于野生型。在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段,rps9m-3植株發(fā)育略晚于野生型,個(gè)體比野生型略小,葉片比野生型略小,抽薹后主莖比野生型弱。這些結(jié)果表明RPS9M突變后影響擬南芥種子的萌發(fā),根、葉、莖的生長(zhǎng)。最后,研究了RPS9 突變對(duì)線粒體功能的影響。對(duì)線粒體核糖體大小亞基rRNAs的含量進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示rps9m-3突變體中線粒體核糖體26S rRNA與18S rRNA含量的比值出現(xiàn)明顯的偏離,暗示著線粒體核糖體的功能發(fā)生紊亂。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),rps9m-3突變體內(nèi)ROS含量明顯高于野生型,且RT-PCR分析表明兩個(gè)與線粒體功能紊亂以及ROS含量升高相關(guān)的指示基因AOX1a和NDB4的表達(dá)在rps9m-3突變體中顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明RPS9M突變影響線粒體的功能。綜上所述,RPS9M不僅在植物的生殖發(fā)育過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用,而且對(duì)根、莖、葉等營(yíng)養(yǎng)器官的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響。這些功能可能主要是通過(guò)RPS9M與錨定蛋白ANK6相互作用調(diào)節(jié)線粒體核糖體的功能,進(jìn)而影響線粒體基因組基因的表達(dá)最終影響線粒體的功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

圖１－１．３０Ｓ核糖體小亞基}D裝圖（引自Ｇ．Ｃｕｌｖｅｒ，邋１９９９）逡逑黑色矩形框代表１６ＳｒＲＮＡ，下部正方形方框表示各核糖體蛋白與ｒＲＮＡ結(jié)合的順域代表一級(jí)綁定蛋白，淺灰色區(qū)域代表二級(jí)綁定蛋白，白色區(qū)域代表三級(jí)}伓ǖ鞍狀窒復(fù)硨頌翹宓鞍字湎嗷プ饔玫那咳酰醬鄭嗷プ饔迷角�，反之覈喕＞忟色喉灺N宓鞍子耄保叮櫻潁遙危鈴澹擔(dān)Ф私岷系乃承潁�，绿色箭头代背岉灺N宓鞍子耄保叮櫻潁遙危林械乃承潁渡反硨頌翹宓鞍子耄保叮櫻潁遙危鈴澹常Ф私岷系乃承頡ｅ義希疲椋紓酰潁邋澹保卞澹裕瑁邋澹幔螅螅澹恚猓歟澹恚幔皰澹錚駑澹常埃渝澹潁椋猓錚螅錚恚幔戾澹螅恚幔歟戾澹螅酰猓酰睿椋翦澹ǎ疲潁錚礤澹牽茫酰歟觶澹潁澹保梗梗梗義襄澹猓歟幔悖脲澹潁澹悖簦幔睿紓歟邋澹潁澹穡潁澹螅螅澹睿翦澹保叮渝澹潁遙危鈴澹幔睿溴澹簦瑁邋澹猓椋睿洌椋睿玨澹錚潁洌澹蟈澹錚駑澹簦瑁邋澹潁椋猓錚螅錚恚幔戾澹穡潁錚簦澹椋睿裕瑁邋澹洌幔潁脲澹紓潁幔澹幔潁澹徨澹椋睿洌椋悖幔簦澹簀澹簦瑁邋澹穡潁椋恚幔潁澹猓椋睿洌椋睿玨澹穡潁錚簦澹椋睿�，邋ｔｈｅ邋e椋紓瑁翦澹紓潁幔澹幔潁澹徨澹椋睿洌椋悖幔簦澹睿洌幔潁澹猓椋睿洌椋睿玨澹穡潁錚簦澹椋睿螅澹幔睿溴澹簦瑁邋澹鰨瑁椋簦邋澹幔潁澹徨澹椋睿洌椋悖幔簦澹簀澹簦瑁邋澹簦澹潁簦椋幔潁澹猓椋睿洌椋睿玨澹穡潁錚簦澹椋睿螅裕瑁邋澹�，邋ａｎｄ邋ｄａｓｈｅｄ邋ａ}潁錚鰨簀澹螅瑁錚麇澹螅簦潁錚睿紓澹鰨澹幔�，邋ａｎｄ邋Ｓz澹潁澹鰨澹幔脲澹椋睿簦澹潁幔悖簦椋錚睿簀澹猓澹簦鰨澹澹鑠澹簦瑁邋澹穡潁錚簦澹悖簦椋觶澹歟澹遙澹溴澹幔潁潁錚鰨簀澹椋睿洌椋悖幔簦邋澹簦瑁邋澹幔螅螅澹恚猓歟澹錚駑澹簦瑁邋澹猓錚洌澹紓潁澹澹鑠澹幔潁潁錚鰨簀澹椋睿洌椋悖幔簦邋澹簦瑁邋澹穡

本文編號(hào)：2631740