【摘要】：白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)已經(jīng)鑒定到它可感染40種蝦,39種蟹,涉及25個國家之多,已成為全球養(yǎng)蝦業(yè)中蔓延最廣、傳播最快、死亡率最高的病毒。日本沼蝦養(yǎng)殖分布廣泛、常年可有,但對WSSV易感性及其防治報道極少。本文將轉(zhuǎn)WSSV-vp28基因的藍藻(Anabaena sp.PCC7120)制劑,用于日本沼蝦口服,探討日本沼蝦與WSSV的感染關系,研究轉(zhuǎn)基因藍藻對日本沼蝦的免疫保護效果,并探討如何防止轉(zhuǎn)基因藍藻在制藥過程中向環(huán)境釋放,以保證抗WSSV藍藻口服劑能夠安全、有效的用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。結果主要如下:(1)用流行病學調(diào)查、不同途徑感染試驗等方法顯示,日本沼蝦是WSSV的自然宿主,自然攜帶率約為8.33%。日本沼蝦可以通過注射、攝食、浸泡途徑感染W(wǎng)SSV,10 d內(nèi)累計感染率均為100%,累計死亡率分別為100%、75%和0%。其中注射途徑感染日本沼蝦,感染后5 d肌肉病毒含量達到感染后1 d的1 000倍,8 d死亡率達100%。用注射WSSV感染日本沼蝦死亡率來測量病毒致死日本沼蝦的半致死劑量(LD50),2.71×105病毒粒子/μL能使日本沼蝦死亡率達到50%以上,此濃度高于南美白對蝦半致死濃度。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中,日本沼蝦可以通過攝食感染W(wǎng)SSV的病蝦或死蝦而感染W(wǎng)SSV,也能通過浸泡在含WSSV的水體中而感染,并因此成為一種傳播媒介,從而影響了 WSSV的迅速傳播與致病。(2)日本沼蝦經(jīng)轉(zhuǎn)vp28藍藻口服劑免疫7d后,投喂感染W(wǎng)SSV的日本沼蝦肌肉組織進行攻毒。攻毒第10d后,陽性對照、野生型、空載體累計死亡率分別高達81.25%、61.5%、87.5%,免疫組1死亡率為56.25%,而免疫組2死亡率僅為37.5%。相比于陽性對照組免疫組1、2存活率分別提高了 25%、43.75%。qPCR檢測攻毒后第4d日本沼蝦的鰓、肝胰腺、尾部肌肉各組織中WSSV含量顯示,各組沼蝦體內(nèi)均能檢測到WSSV,陽性、野生型、空載體三組對照各組織WSSV含量無差異,免疫組WSSV含量明顯低于對照組;與對照組相比,免疫組1的鰓、肝胰腺、肌肉中WSSV含量均降低了 102倍,免疫組2的鰓、肝胰腺中WSSV分別降低了 104倍、103倍,肌肉中含量低于102copies/mg;攻毒后,三組對照組的鰓和肝胰腺細胞都出現(xiàn)大量細胞破裂、壞死、細胞核脫落等WSSV病灶癥狀;免疫組1的鰓、肝胰腺組織細胞部分出現(xiàn)了病灶現(xiàn)象,組織健康明顯優(yōu)于攻毒對照組;而免疫組2的鰓和肝胰腺組織細胞基本未發(fā)生病理現(xiàn)象。各組肌肉組織細胞,未發(fā)現(xiàn)WSSV病理現(xiàn)象。轉(zhuǎn)vp28藍藻口服劑處理日本沼蝦后,提高了沼蝦抵抗WSSV的免疫力,減少了 WSSV在體內(nèi)的增殖,有效保護了日本沼蝦的鰓、肝胰腺等組織,從而提高了日本沼蝦的存活率。(3)制備轉(zhuǎn)基因藥物的前提是其安全性,這種安全性包括對人和環(huán)境兩方面。對我們構建的轉(zhuǎn)基因藍藻,由于未進入食物鏈,環(huán)境釋放影響自然界生態(tài)平衡更重要。用pH法處理轉(zhuǎn)基因藍藻后,在不同時間、溫度和光照下觀察效果,并用響應面法優(yōu)化處理條件。最佳處理條件為:pH≤2.5、t≥50min、T≥30 ℃或pH≥12、t≥120 min、T≥30℃,殺藻率為100%。兩個優(yōu)化組合分別為:pH2.12、溫度29.96℃、時間33.9 min或pH 12.33溫度31.75 ℃、時間96.8 min。pH處理后的轉(zhuǎn)基因藍藻在平板上不能再繼續(xù)生長。pH法對轉(zhuǎn)基因藍藻的殺藻率可達100%,有效防止了轉(zhuǎn)基因藍藻在制備對蝦口服劑過程中向環(huán)境釋放。上述結果首次證明了日本沼蝦對WSSV的易感性低于南美白對蝦,意味著日本沼蝦可能含有內(nèi)源的抗WSSV機制,也顯示這種蝦在WSSV感染區(qū)有推廣價值。通過宏觀死亡率及微觀病毒含量和病理切片證明了轉(zhuǎn)vp28藍藻口服劑對日本沼蝦有免疫效果,可用于此蝦的WSSV防治。另外,本研究創(chuàng)立的pH法可有效防止轉(zhuǎn)基因藍藻在制備抗WSSV 口服劑過程中發(fā)生環(huán)境釋,保證了本口服藥的安全生產(chǎn)。
【圖文】：

上海海洋大學碩士＇學位論文逡逑２－１）邋＾通過提取死亡及未死亡ｇ本沼蝦ＮＤＡ，進行ＰＣＲ及電泳實驗后表明未逡逑死亡日本沼蝦也己經(jīng)感染ＷＳＳＶ邋（圖２－２）邋＾實驗結果表明，日本招蝦可以通過逡逑攝食感染ＷＳＳＶ的病蝦或死蝦而感染ＷＳＳＶ。逡逑２．３日本沼蝦注射感染ＷＳＳＶ逡逑定量注射ＷＳＳＶ病毒液后，２４邋ｈ后日本沼蝦就出現(xiàn)了食欲減退狀況，４８邋ｈ逡逑后幾乎不進行攝食，以及出現(xiàn)反應遲鈍、頭胸部腫脹等癥狀，隨后又出現(xiàn)了部分逡逑脫落癥狀，而且日本沼蝦感染后至死亡和Ｒ服感染一樣也一直未出現(xiàn)白斑癥狀。逡逑在感染４８邋ｈ后出現(xiàn)了少量死亡７邋７２邋ｈ時出現(xiàn)大量死亡，：９６邋ｈ時累計死亡量超過逡逑５０％，隨后死亡速度下降，，１９２邋ｈ時累計死亡率為１００％，另外兩個陰性對照組至逡逑實驗結束分別死亡２尾和４尾（圖２－３）邐取日本沼蝦的肌肉組織進行定量ＰＣＲ逡逑檢測表明，感染病毒２４邋ｈ后肌肉組織中的ＷＳＳＶ含量隨著時間增加急劇增加，逡逑９６邋ｈ后增長減緩，１２０邋ｈ瀕死的日本沼蝦肌肉內(nèi)ＷＳＳＶ含量是感染１２邋ｈ時肌肉含逡逑量的１邋０００倍。研宄結果表明

通過將提純并測定濃度的ＷＳＳＶ進行梯度稀釋，然后對日本沼蝦進ｆｉ１注射逡逑感染，結果顯示，在１０Ｇ－１０２稀釋組的死亡率為１００％，１０３稀釋組為５７．１％，ｇ逡逑稀釋１0４倍時死亡率低于５０％邋Ｃ圖２－５）。另外，高濃度病毒液都能引起日本沼逡逑蝦１００％的死亡，并隨著病毒液的稀釋，死亡率開始下降，并且各組死亡率依次逡逑降低。由此，可以計算出病毒導致發(fā)病死亡的ＬＤ５ｑ為１．２６Ｘ１０５病毒粒子／叫。實逡逑驗結果也意味著在攻毒實驗中可以用１0２稀釋度作為攻毒劑量《死亡率可達逡逑１００％，此時病毒濃度為：２．７１＞＜１0６病毒粒子／｜ｉＬ。逡逑１００邐－邐＿Ｂ＿１0０邐０邐＾逡逑，彐：逡逑６邐■邋＋ｉ0４邐／／／逡逑［一逡逑邐，邐｜邐，邐ｉ邐，邐ｉ邐
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S945.4

【共引文獻】

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本文編號：2630986