【摘要】：目的:隨著老齡人越來越多,血管鈣化(vascular calcification,VC)發(fā)病率越來越高;VC,作為心血管疾病的并發(fā)癥,增加其發(fā)病率和死亡率。臨床研究表明,雌激素療法明顯降低冠狀動脈鈣化的發(fā)病率。一些實(shí)驗(yàn)研究顯示,雌激素E2/雌激素受體α(ERα)通過影響COX2,RANKL,Gas6進(jìn)而抑制VC。提示雌激素受體α(ERα)在VC中扮演著重要保護(hù)角色。ERα是核受體重要成員之一。去泛素化酶USP22是泛素蛋白酶系統(tǒng)的組成部分,也許在心血管疾病中發(fā)揮重要作用,但其機(jī)制未見報道。USP22作為核受體的輔調(diào)節(jié)因子,在前列腺癌中參與雄激素受體(AR)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。USP22是否參與ERα介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控未見報道。本研究目的建立人主動脈平滑肌細(xì)胞(hASMCs)鈣化模型,證實(shí)USP22參與ERα介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)而在血管鈣化中發(fā)揮重要作用。方法:將hASMCs分別接種于正常DMEM培養(yǎng)基,含1.25Mmol/Lβ-磷酸甘油和0.625Mmol/L氯化鈣(1.25Mm CAL)、2.5Mmol/Lβ-磷酸甘油和1.25Mmol/L氯化鈣(2.5Mm CAL)、5Mmol/Lβ-磷酸甘油和2.5Mmol/L氯化鈣(5Mm CAL)的鈣化DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)0、3、7、9天。用1%/2%Alizarin-red S染料染色,在倒置相差顯微鏡下成像;在5Mm CAL條件下培養(yǎng)0,3,7,9天,Western blot實(shí)驗(yàn)檢測鈣化相關(guān)蛋白BMP2,RANKL,COX2,Gas6,ERα的表達(dá)。熒光素酶雙基因報告實(shí)驗(yàn)檢測在hASMCs中,去泛素化酶USP22是否參與ERα介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控;過表達(dá)USP22,Western blot實(shí)驗(yàn)檢測鈣化相關(guān)因子BMP2,RANKL,COX2,Gas6,ERα的蛋白表達(dá)。結(jié)果:在1.25Mm CAL DMEM培養(yǎng)條件下第9天hASMCs有明顯的鈣沉積;在2.5Mm CAL、5Mm CAL DMEM培養(yǎng)條件下第7天hASMCs出現(xiàn)鈣沉積,第9天有明顯鈣沉積。hASMCs在5Mm CAL DMEM培養(yǎng)條件下,BMP2蛋白表達(dá)增加,提示平滑肌細(xì)胞表型向成骨表型轉(zhuǎn)變;去泛素化酶USP22蛋白表達(dá)增加,提示USP22可能促進(jìn)hASMCs鈣化。熒光素酶雙基因報告及過表達(dá)USP22后western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示USP22抑制ERα介導(dǎo)的下游基因Gas6轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)而促進(jìn)hASMCs鈣化。結(jié)論:在5Mm CAL濃度培養(yǎng)的條件下,平滑肌細(xì)胞表型向成骨表型轉(zhuǎn)變;去泛素化酶USP22蛋白表達(dá)增加,可知USP22可能推動了血管鈣化(VC)的進(jìn)程。USP22抑制ERα介導(dǎo)的下游基因Gas6的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而促進(jìn)人主動脈平滑肌細(xì)胞(hASMCs)鈣化。
【圖文】：

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果.1 人主動脈平滑肌細(xì)胞鈣化模型建立將 hASMCs 分別接種于正常 DMEM（0Mm CAL），含 1.25Mmol/Lβ-磷酸甘 0.625Mmol/L 氯化鈣（1.25Mm CAL）DMEM、 2.5Mmol/Lβ-磷酸甘油.25Mmol/L 氯化鈣（2.5Mm CAL）DMEM、5Mmol/Lβ-磷酸甘油和 2.5Mmol/L鈣（5Mm CAL）鈣化 DMEM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 0、3、7、9 天。 0Mm CAL 為組，0、3、7、9 天染色，沒有橘紅色出現(xiàn)，即沒有鈣沉積出現(xiàn)；1.25Mm CAL DME養(yǎng)條件下，0、3、7 天沒有染成橘紅色，即沒有鈣沉積出現(xiàn)，9 天出現(xiàn)明顯橘，即出現(xiàn)明顯鈣沉積；2.5Mm CAL、5Mm CAL DMEM 培養(yǎng)條件下，0、3 天鈣沉積出現(xiàn)（沒有染成橘紅色），第 7 天出現(xiàn)少量鈣沉積，第 9 天出現(xiàn)明顯鈣。結(jié)果如圖 3.1。

圖 3.2. 倒置相差顯微鏡高倍鏡下觀察 hASMCs 鈣化情況（X100）用 含 5Mm CAL 的 DMEM 培 養(yǎng) 基 培 養(yǎng) hASMCs ， 培 養(yǎng) 9 天 ， 分 別 用1%Alizarin-red S 和 2% Alizarin-red S 染料染色，倒置相差顯微鏡成像，染成橘紅色為鈣沉積；根據(jù)染色結(jié)果提示，1%Alizarin-red S 為最佳 hASMCs 鈣化染色濃度，，結(jié)果圖 3.3。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R54

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 彭利靜;拓步雄;李超民;;Caspase-1抑制劑對大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化的初步影響[J];生物技術(shù)通訊;2014年02期

本文編號：2630835