【摘要】：目的:既往研究顯示大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體(BMSCs-exosomes)富含信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)蛋白,但干細胞源外泌體是否能夠通過傳遞STAT3蛋白的方式修復(fù)梗死心臟,目前尚未證實。為證明該假說,本實驗采用攜帶增強型綠色熒光蛋白(GFP)慢病毒表達載體,構(gòu)建過表達STAT3基因及RNA干擾STAT3基因慢病毒,分別轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs),然后提取各自來源的外泌體(exosomes),在蛋白水平上修飾exosomes,為下一步研究干細胞exosmes的作用機制奠定基礎(chǔ)。方法:(1)原代細胞分離培養(yǎng):取SD大鼠雙側(cè)股骨、脛骨,用培養(yǎng)基沖洗骨髓腔收集沖洗液貼壁培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞。(2)流氏細胞儀:檢測BMSCs表面特異性標記物。(3)慢病毒載體的構(gòu)建:構(gòu)建過表達STAT3基因及siRNA-STAT3基因的慢病毒載體用以轉(zhuǎn)染293T細胞并包裝慢病毒。(4)BMSCs慢病毒感染:分別以攜帶STAT3過表達和siRNA-STAT3慢病毒感染BMSCs,獲得STAT3基因修飾的BMSCs。(5)免疫熒光顯微鏡:檢測攜帶GFP慢病毒載體轉(zhuǎn)染后BMSCs內(nèi)熒光蛋白表達。(6)外泌體分離試劑盒:分離獲得外泌體。(7)Western blot:檢測exosomes特異性標記物CD9/CD63/CD81及STAT3總蛋白。(8)透射電鏡:觀察所分離得到外泌體的形態(tài)。結(jié)果:(1)提取骨髓原代MSCs為長梭型,兩端有較長突起,均勻分布生長,當細胞融合度達到90%以上,呈漩渦樣分布。(2)取第四代BMSCs做流氏表型分析發(fā)現(xiàn)皆表達CD29/CD44/CD90/CD105,其中CD90的表達陽性率高達99%;均不表達CD34和CD45,說明兩種細胞均表達典型的干細胞表面標記并且細胞純度較高。(3)免疫熒光顯微鏡觀察到293T細胞被轉(zhuǎn)染呈現(xiàn)綠色熒光,以MOI值為8的慢病毒感染BMSCs后,通過免疫熒光顯微鏡能夠觀察到大量的綠色熒光表達,提示感染成功。(4)用外泌體分離純化試劑盒按說明書提取的沉淀即為exosomes,于-80°C保存。(5)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)提取的外泌體表達CD9/CD81/CD63,符合外泌體標志蛋白。(6)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)BMSCs所分離的外泌體表達STAT3,進行慢病毒轉(zhuǎn)染后,過表達STAT3-BMSCs-exosomes對STAT3表達升高;siRNA-STAT3-BMSCs-exosomes對STAT3表達降低。(7)透射電鏡下可見BMSCs-exosomes呈圓形或橢圓形,直徑在30-100nm,有典型的杯底凹槽樣結(jié)構(gòu)。結(jié)論:1.骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體富含STAT3蛋白2.慢病毒轉(zhuǎn)染后,過表達STAT3使相關(guān)外泌體STAT3明顯升高;干擾Si-STAT3使相關(guān)外泌體STAT3明顯下降。3.過表達STAT3及siRNA-STAT3慢病毒載體轉(zhuǎn)染MSCs外泌體的分離獲取為下一步研究干細胞exosomes通過傳遞STAT3蛋白修復(fù)梗死心臟的作用及機制奠定了堅實的基礎(chǔ)。
【圖文】：

代 BMSCs（×400，細胞融合約 40%）；C. 第 4 代 BMSCs（×100，細胞融合約90%以上）。1.2 骨髓間充質(zhì)干細胞的表型特征為探究細胞的表型特征，，取第 4 代 BMSCs 用流式的方法做了免疫表型分析。流氏細胞儀檢測 CD29、CD44、CD90、CD105 陽性率均表達 99%以上；均不表達CD34和CD45，說明兩種細胞均表達典型的干細胞表面標記并且細胞純度較高。說明培養(yǎng)的第 4 代 BMSCs 具有 MSCs 的特異性表型特征。進一步證明本實驗提取的骨髓細胞為間充質(zhì)干細胞。

泳道 10:GPH-r_STAT3-SH2 酶切 1泳道 11:GPH-r_STAT3-SH2 酶切 2泳道 12:GPH-r_STAT3-SH2 酶切 3泳道 13:GPH-r_STAT3-SH3 質(zhì)粒泳道 14:GPH-r_STAT3-SH3 酶切 1泳道 15:GPH-r_STAT3-SH3 酶切 2泳道 16:GPH-r_STAT3-SH3 酶切 33. 慢病毒的包裝及滴度檢測3.1 STAT3 慢病毒的成功包裝構(gòu)建好的帶有熒光蛋白GFP表達質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染試劑lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染293T細胞 24h 后，通過熒光顯微鏡觀察到細胞被轉(zhuǎn)染呈現(xiàn)綠色熒光，表明 STAT3 載體轉(zhuǎn)染 293T 細胞成功(圖 5)。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R542.22

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本文編號：2630172