發(fā)布時(shí)間：2020-04-16 09:41

【摘要】：研究目的:庫欣病是由于垂體促腎上腺皮質(zhì)激素(AC'TH)腺瘤產(chǎn)生過多ACTH,導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)分泌過多糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇)的一種疾病,其復(fù)發(fā)率高,高皮質(zhì)醇血癥引起的并發(fā)癥累及全身多個(gè)系統(tǒng),患者預(yù)后很差。糖皮質(zhì)激素受體(GR)由Nuclear Receptor Subfamily 3 Group C Member 1(NR3C1)基因編碼,在垂體 ACTH 分泌細(xì)胞的負(fù)反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究在4例庫欣病患者的垂體ACTH腺瘤中發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞NR3C1基因突變,突變位點(diǎn)為c.1405CT(p.R469*),c.2077TG(p.Y693D),c.2173AG(p.M725V)和 c.2098GC(p.A700P),c.1769AG(p.D590G)和 c.1750TG(p.F584V)。本研究旨在驗(yàn)證 NR3C1 基因突變 c.1405CT(p.R469*)、c.1769AG(p.D590G)、c.2077TG(p.Y693D)對于 GR 蛋白的功能的影響,進(jìn)一步探索NR3C1基因突變在垂體ACTH腺瘤發(fā)生機(jī)制中的作用。研究方法:收集庫欣病患者臨床資料,并對其手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫組化研究。構(gòu)建野生型和突變型NR3C1基因的表達(dá)質(zhì)粒,通過陽離子脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù),將野生型和突變型質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至小鼠垂體瘤細(xì)胞(AtT-20),觀察野生型和突變型GR蛋白在AtT-20細(xì)胞中的表達(dá)和定位差異。在此基礎(chǔ)上,檢測野生型和突變型NR3C1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AtT-20細(xì)胞后,Pomc mRNA和POMC蛋白水平的變化;進(jìn)一步將野生型和突變型NR3C1表達(dá)載體分別與含有P0MC基因啟動(dòng)子序列的螢光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染,通過檢測雙螢光素酶的活性,研究野生型和突變型GR蛋白對POMC啟動(dòng)子的活性的影響。研究結(jié)果:1.GR蛋白在垂體腺瘤組織中的表達(dá)特征與臨床相關(guān)性垂體ACTH腺瘤的GR蛋白組織水平表達(dá)顯著高于其他垂體腺瘤病理亞型。NR3C1基因突變患者腫瘤組織的GR蛋白表達(dá)相對較高。GR免疫組化染色強(qiáng)度與患者年齡、腫瘤最大徑、發(fā)病年齡、術(shù)前及術(shù)后血總皮質(zhì)醇和ACTH水平均無顯著相關(guān)性。復(fù)發(fā)性垂體ACTH腺瘤的GR免疫組化評(píng)分顯著高于非復(fù)發(fā)組(p=0.0023),評(píng)分大于27.22時(shí),判斷復(fù)發(fā)性的診斷敏感性為50%,特異性為79.41%。GR蛋白免疫組化染色強(qiáng)度與術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間間隔呈正相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r=0.4769(p=0.0454)。2.含有目標(biāo)突變的pcDNA3.1(+)-mut-NR3C1表達(dá)載體的構(gòu)建比對突變型質(zhì)粒測序結(jié)果與野生型模板序列(NM_000176.2),目標(biāo)突變c.1405CT(p.R469*)、c.1769AG(p.D590G)、c.2077TG(p.Y693D)突變位點(diǎn)正確,除突變位置外,其余序列與野生型基因序列一致。3.細(xì)胞水平野生型和突變型GR蛋白表達(dá)和定位差異蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),相較于野生型GR蛋白,p.D590G和p.Y693D突變型GR蛋白水平均顯著減低,p.R469*突變?yōu)闊o義突變,所表達(dá)的GR為截短蛋白。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),p.R469*、p.D590G和p.Y693D突變型GR蛋白在細(xì)胞核中的分布較野生型明顯減低。4.野生型和突變型GR蛋白過表達(dá)對于P0MC基因表達(dá)的影響GR蛋白對于POMC啟動(dòng)子的抑制作用呈劑量依賴性模式,且受配體濃度的影響,隨著GR蛋白水平增多、配體濃度的升高,POMC轉(zhuǎn)錄水平逐漸減少。在三種野生型GR蛋白+配體的作用下,共轉(zhuǎn)染的POMC啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒表達(dá)螢光素酶沒有被抑制。無配體處理時(shí),突變型p.R469*和p.D590G質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組AtT-20細(xì)胞的Pomc mRNA和POMC蛋白水平顯著高于野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。5.野生型和突變型GR蛋白過表達(dá)對于增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響過表達(dá)GR蛋白的AtT-20細(xì)胞中Cables1 mRNA水平顯著降低,但野生型和突變型組間無顯著差別,經(jīng)過地塞米松處理后,野生型和突變型GR蛋白過表達(dá)組的Cablesl基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著升高,但組間無明顯差別。研究結(jié)論:垂體ACTH腺瘤組織中GR蛋白表達(dá)顯著高于其他類型垂體腺瘤,復(fù)發(fā)性垂體ACTH腺瘤的GR蛋白表達(dá)顯著升高。野生型NR3C1和突變型NR3C1在AtT-20細(xì)胞中存在表達(dá)差異,突變型p.D590G和p.Y693DGR蛋白的表達(dá)量較野生型顯著減少,p.R469*GR蛋白為截短蛋白。三種突變型GR蛋白在配體作用下進(jìn)入細(xì)胞核的能力受損。野生型和突變型GR蛋白對POMC基因表達(dá)的調(diào)控作用存在差異,三種野生型GR蛋白在與配體的作用下,抑制POMC轉(zhuǎn)錄的能力減弱,未經(jīng)配體處理時(shí),突變型p.R469*和p.D590G GR蛋白使POMC基因表達(dá)增多。GR蛋白過表達(dá)可減少AtT-20細(xì)胞中Cables1基因的表達(dá),野生型和突變型GR蛋白對Cables1基因的調(diào)控沒有顯著差異。
【圖文】：

＿邐ｙ、Ｖ＇逡逑圖１－１７Ｖ／？Ｃ７基因突變陽性患者（切片編號(hào)２３）垂體ＡＣＴＨ腺瘤手術(shù)標(biāo)本ＧＲ免疫逡逑組化染色（ｂａｒ＝５０ｊｉｍ），一抗為抗ＧＲ單克隆抗體（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，美國），稀釋逡逑倍數(shù)ｈ２００逡逑＾ｎｒ：＼■：｛，，：．．，逡逑圖１－２７Ｖ／？Ｃ７基因突變陽性患者（切片編號(hào)２８）垂體ＡＣＴＨ腺瘤手術(shù)標(biāo)本ＧＲ免疫逡逑組化染色（ｂａｒ＝５０｜ｉｍ），一抗為抗ＧＲ單克隆抗體（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，美國），稀釋逡逑倍數(shù)１：２００逡逑３２逡逑

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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R586

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2629642