【摘要】：隨著轉(zhuǎn)基因作物種植種類和種植面積的增加,轉(zhuǎn)基因作物的安全性問(wèn)題引起了廣泛關(guān)注。水稻是全球最重要的糧食作物之一,對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的非預(yù)期性變異評(píng)估是轉(zhuǎn)基因水稻安全性評(píng)價(jià)的一項(xiàng)重要內(nèi)容。內(nèi)生微生物包括定殖在健康植物體內(nèi)的內(nèi)生細(xì)菌和真菌,轉(zhuǎn)基因水稻種子內(nèi)生菌菌群分布和結(jié)構(gòu)的變異可能影響其食品和生態(tài)安全性。我們以轉(zhuǎn)2mG2-epsps基因水稻為材料,比較分析了日本晴、D349和觀28 3個(gè)品系轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻種子內(nèi)生細(xì)菌菌群的分布差異,并監(jiān)測(cè)了兩種儲(chǔ)藏條件下日本晴和D349品系轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻種子的可培養(yǎng)內(nèi)生真菌菌群的分布差異和隨儲(chǔ)藏時(shí)間增長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)變化,還篩選出了一對(duì)適用于水稻種子內(nèi)生細(xì)菌PCR的高通量引物,從宏基因組層面對(duì)日本晴水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。主要結(jié)果如下:(1)水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的檢出存在很大的不穩(wěn)定性,重復(fù)檢測(cè)15次后水稻種子可分離內(nèi)生細(xì)菌的菌群種類才能達(dá)到穩(wěn)定。從所有水稻種子樣本中分離出7個(gè)類群的內(nèi)生細(xì)菌,代表菌株經(jīng)鑒定分別Pantoea、Pseudomonas、Leucobacter、Enterobacter、Bacillus、Bactirum、Microbacterium,其中親本水稻種子優(yōu)勢(shì)菌屬為B1(Pantoea)和B5(Bacillus)。比較三個(gè)水稻品系發(fā)現(xiàn),不同品系水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的定殖受2mG2-epsps基因的影響有較大的差異。P1和P3品系水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的定殖數(shù)量的增加受2mG2-epsps基因插入的影響較大,而P2水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的定殖數(shù)量受組織培養(yǎng)的影響較大;基因插入增加了 B2(Pseudomonas)在種子水稻種子中的定殖,并使B1(Pantoea)在P3中定殖顯著增加,而P2品系水稻種子中B1(Pantoea)的定殖主要受到組織培養(yǎng)效應(yīng)的影響,使其定殖量顯著增加,基因插入和組織培養(yǎng)顯著抑制了 B5(Bacillus)在P3品系種子中的定殖量。(2)以3個(gè)品系轉(zhuǎn)基水稻種子利用PTN系統(tǒng)追溯GM水稻種子內(nèi)生細(xì)菌定殖量變異的來(lái)源,發(fā)現(xiàn)P1品系GM水稻種子可培養(yǎng)真菌變異可能主要受到基因插入和轉(zhuǎn)基因過(guò)程中的組織培養(yǎng)的影響不同,而P2和P3品系GM水稻種子可培養(yǎng)真菌變異可能主要受到轉(zhuǎn)基因過(guò)程中的組織培養(yǎng)的影響,受基因插入影響較小。(3)采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法跟蹤監(jiān)測(cè)了日本晴P1和D349P2兩個(gè)品系在室溫和4℃儲(chǔ)藏條件下轉(zhuǎn)基因與其非轉(zhuǎn)基因水稻種子可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的菌群隨時(shí)間的變化。從水稻種子中共分離出47株內(nèi)生真菌,歸為22個(gè)屬,47個(gè)種,優(yōu)勢(shì)類群是Dendryphiella、Curvularia和Fusarium,相對(duì)分離頻率分別為59.01%、15.51%和8.16%。比較兩種儲(chǔ)藏條件發(fā)現(xiàn),4℃儲(chǔ)藏條件下水稻種子中的帶菌率和種類數(shù)均高于室溫條件,4℃儲(chǔ)藏條件更能維持水稻種子中真菌的活性。比較兩個(gè)水稻品系發(fā)現(xiàn),2mG2-epsps基因插入從總體上增加了水稻種子內(nèi)生真菌的定殖量和種類數(shù),使其帶菌率升高;隨著種子儲(chǔ)藏時(shí)間的增長(zhǎng),轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻種子的帶菌率和檢出種類均呈下降趨勢(shì),P1品系轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的相似度逐漸上升,P2品系的相似度逐漸下降,不同品系水稻內(nèi)生真菌的定殖受2mG2-epsps基因的影響程度有較大差異。(4)7對(duì)高通量測(cè)序細(xì)菌PCR引物的引物序列通過(guò)blast同源性比對(duì)和與水稻基因組的Primer-blast比對(duì),以及高通量測(cè)序驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)引物對(duì)Pr7(fM1和rC1)更適合作為水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的引物用于高通量PCR擴(kuò)增,能減少水稻細(xì)胞器基因的干擾。應(yīng)用引物Pr7進(jìn)行的Illumina MiSeq高通量測(cè)序的結(jié)果分析日本晴種子內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu),將日本晴水稻種子內(nèi)生細(xì)菌類群歸為62個(gè)OTU,分為6個(gè)門(mén),10個(gè)綱,17個(gè)目,23個(gè)科,37個(gè)屬,優(yōu)勢(shì)菌為泛菌屬(Pantoea)、Candidatus Kuenenia屬和乳球菌屬(Lactococcus),占比分別為3.19%、0.09%和 0.06%。
【圖文】：

２．４．２水稻種子可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察逡逑表面消毒后的ＧＭ水稻及其多重對(duì)照樣本水稻種子勻漿在ＬＢ平板２８°Ｃ恒逡逑溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)２－５天，每隔２４邋ｈ觀察菌落生長(zhǎng)情況（如圖２－１），從ＬＢ逡逑平板中挑出形態(tài)、顏色和革蘭氏染色不同的代表單菌落進(jìn)行劃線純化（圖２－２），逡逑并觀察菌落形態(tài)特征匯總于表２－２，圖２－３顯示各細(xì)菌類群代表菌株的革蘭氏染逡逑色結(jié)果�？芍蛛x的內(nèi)生細(xì)菌共分為８類，其中Ｂｌ、Ｂ２、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ８是革蘭逡逑氏陽(yáng)性菌，Ｂ３和Ｂ４、Ｂ７是革蘭氏陰性菌，顯微鏡觀察菌的形態(tài)，大小都在１？逡逑４＾ｍ之間，都是桿菌。逡逑圖２－１水稻種子內(nèi)生細(xì)菌在ＬＢ平板上的分離菌落形態(tài)和消毒對(duì)照逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋ｃｏｌｏｎｙ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ邋ｂａｃｔｅｒｉａ邋ａｎｄ邋ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｉｎ邋ＬＢ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑圖２－２水稻種子內(nèi)生細(xì)菌在ＬＢ平板上的菌落形態(tài)逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｔｈｅ邋ｃｏｌｏｎｙ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ邋ｂａｃｔｅｒｉａ邋ｏｆ邋ｒｉｃｅ邋ｓｅｅｄｓ邋ｉｎ邋ＬＢ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑ｖ邐■■■邋ＨＨＩ逡逑Ａ哪、，＞ｔ逡逑．．＇Ａ；：邐：：逡逑．ａ泌：士？、．－＝邐：逡逑Ｂｉ邐Ｂ２邐Ｂ３邐Ｂ４逡逑－邐Ｂ＇６＾＇邐ｂ－？逡逑圖２－３水稻種子內(nèi)生菌革蘭氏染色形態(tài)逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｔ

圖３－１水稻種子內(nèi)生真菌在ＰＤＡ平板上的菌落形態(tài)逡逑Ｆｉｇ３－１邋Ｔｈｅ邋ｃｏｌｏｎｙ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ邋ｆｕｎｇｉ邋ｉｎ邋ＰＤＡ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑圖３－２部分內(nèi)生真菌ＤＮＡＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖逡逑Ｆｉｇ．３－２邋Ｐａｒｔｉａｌ邋ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ邋ｆｕｎｇａｌ邋ＤＮＡ邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ逡逑２７逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江工商大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q93;S511

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2628435