【摘要】：目的:構(gòu)建ECEL1基因的慢病毒載體。方法:1.依照ECEL1基因?yàn)槟０?設(shè)計(jì)RNA干擾靶點(diǎn),根據(jù)選定的靶點(diǎn)序列,設(shè)計(jì)短發(fā)夾RNA(sh RNA)干擾序列,在兩端添加相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn),合成單鏈DNA oligo,退火緩沖液中配對形成雙鏈DNA oligo。利用Age I和Eco RI雙酶線性化GV115載體。把載體和DNA oligo相連接,其連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)PCR擴(kuò)增并測序鑒定。再通過質(zhì)粒抽提,轉(zhuǎn)染,濃縮與純化后獲得重組的ECEL1基因RNAi慢病毒,用“HIV-1 p24抗原ELISA法”測定樣品滴度。2.ECEL1基因RNA干擾慢病毒感染人肝癌細(xì)胞(BEL-7404),并設(shè)置對照組,熒光觀察顯示感染率。并使用real-time PCR法檢測人肝癌細(xì)胞(BEL-7404)中ECEL1基因敲減后m RNA的表達(dá)量。結(jié)果:1.照ECEL1基因模板設(shè)計(jì)后,選定psc48784片段作為RNA干擾靶點(diǎn),制備雙鏈DNA oligo,PCR鑒定陽性重組子并測序,驗(yàn)證psc48784為正確的克隆。經(jīng)過質(zhì)粒抽提,轉(zhuǎn)染以及濃縮純化后,成功構(gòu)建ECEL1基因RNAi慢病毒。物理檢測與無菌檢測合格。以及通過HIV-1 p24抗原ELISA法測定ECEL1基因RNAi慢病毒樣品病毒滴,測樣品病毒滴度為3E+8TU/m L。表明已成功構(gòu)建高滴度且合格的ECEL1基因RNA干擾慢病毒。2.ECEL1基因RNAi慢病毒感染人肝癌細(xì)胞(BEL-7404),并設(shè)置對照組,于72小時(shí)后鏡下熒光觀察,觀察結(jié)果顯示細(xì)胞感染效率達(dá)到80%,細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定。使用real-time PCR的方法,實(shí)驗(yàn)組人肝癌細(xì)胞(BEL-7404)細(xì)胞中ECEL1基因在m RNA水平的表達(dá)量受到抑制(p0.05),敲減效率達(dá)到70.5%。結(jié)論:成功構(gòu)建ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒載體并獲得穩(wěn)定高滴度的病毒樣品。并獲得穩(wěn)定的ECEL1基因敲減的人肝癌細(xì)胞(BEL-7404),為下一步探討ECEL1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的功能影響奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 2.1 RNAi 載體構(gòu)建以及陽性克隆鑒定示意圖.2.3.3.2 引物定引物序列（見表 2.3）：表 2.3 鑒定引物表鑒定引物 序列（5’→3’）-F CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-R GTAATACGGTTATCCACGCG.2.3.3.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增鑒定1）按照（表 2.4）的成分配制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系，震蕩并混合均勻，入離心機(jī)短時(shí)間離心。2）在超凈工作臺上操作，單個(gè)菌落為模板，用無菌槍頭挑取出，吹打混合勻，放置于 PCR 儀中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增（反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間分別為：4℃ 3min；94℃ 30s； 55℃ 30 s；72℃ 30s，反復(fù)循環(huán) 22 次；72℃ 5min）。

ECEL1 基因 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠0kb，8kb，，6kb，5kb，4kb，3.5從上至下）組子結(jié)果 ： shRNA 片段的陽性克隆 PCRp（圖 3.2）。判斷 psc487
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2628252