【摘要】：鉀離子(K~+)是植物細胞內(nèi)含量最豐富的一價陽離子,在植物的生長和發(fā)育過程中具有重要作用。足夠的K~+供應(yīng)能夠增強作物對各種生物和非生物脅迫(如干旱、高鹽等)的耐受性,而K~+不足植物會表現(xiàn)出葉色發(fā)黃、生長受抑制等缺鉀癥狀。前人研究表明植物對K~+的吸收、轉(zhuǎn)運與分配主要通過鉀離子轉(zhuǎn)運通道蛋白和鉀離子轉(zhuǎn)運體完成,而鉀離子轉(zhuǎn)運體被認為是高親和性鉀吸收系統(tǒng)中的主要成員,負責(zé)逆電化學(xué)梯度對K~+進行主動運輸,并使其在體內(nèi)高度富集。其中HAK/KUP/KT家族是鉀離子轉(zhuǎn)運體最龐大的一個家族,在水稻、擬南芥和白楊中已經(jīng)分別鑒定出27、13和31個HAK家族基因。目前,在小麥中HAK家族基因只有TaHAK1和TaHAK11被克隆,但是對該家族基因功能的研究還很少。本研究利用同源克隆的方法得到小麥HAK家族基因TaHAK1-B、TaHAK5、TaHAK10、TaHAK14-A和TaHAK14-B,通過熒光定量PCR(qRT-PCR)分析基因的表達情況;利用煙草瞬時表達系統(tǒng)對TaHAK1-B基因進行了亞細胞定位分析;借助缺陷型酵母系統(tǒng)異源表達TaHAK1-B,初步鑒定該基因具有轉(zhuǎn)運鉀離子和鈉離子的功能;并通過在野生型擬南芥中過表達TaHAK1-B,進一步驗證該基因在植物中的功能。主要研究結(jié)果如下:(1)從普通六倍體小麥品種矮抗58的gDNA中擴增得到TaHAK1-B基因,基因長度3092 bp,cDNA中擴增到TaHAK1-B基因ORF 2307 bp,編碼768個氨基酸;TaHAK5基因ORF 2358 bp,編碼785個氨基酸;TaHAK10基因ORF 2484 bp,編碼827個氨基酸;TaHAK14-A和TaHAK14-B基因ORF均為2562 bp,編碼853個氨基酸。進化分析發(fā)現(xiàn)TaHAK1-B、TaHAK5屬于HAK家族進化簇Ⅰ,TaHAK10屬于HAK家族進化簇Ⅱ,TaHAK14-A和TaHAK14-B屬于HAK家族進化簇Ⅴ。(2)利用qRT-PCR方法對這些基因在小麥不同組織中的表達情況進行了分析,發(fā)現(xiàn)這四個基因在根、莖、幼葉、老葉及籽粒中均有表達。TaHAK1-B在小麥根部表達量最高,其次是莖;TaHAK5在小麥幼葉中表達量最高,其次是莖、老葉;TaHAK10組織表達模式類似于TaHAK5;TaHAK14基因在小麥莖中表達量最高,其次是葉片。(3)在耐低鉀品種豫農(nóng)186(YN186)中,通過qRT-PCR分析四個基因在缺鉀條件下根和葉中的表達模式。TaHAK1-B基因的表達在根中明顯受鉀離子脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達;TaHAK5基因經(jīng)缺鉀脅迫在葉片中表達明顯上調(diào),缺鉀處理12 h表達量最高,約為0 h的11倍,但其在根中則變化不明顯;TaHAK10和TaHAK14均受鉀離子脅迫在葉片中被誘導(dǎo)上調(diào)表達,而其在根中的表達幾乎不受影響。(4)利用煙草瞬時表達系統(tǒng)進行亞細胞定位分析,發(fā)現(xiàn)TaHAK1-B定位于細胞膜上,表明TaHAK1-B蛋白可能在細胞膜上發(fā)揮功能。(5)在鉀敏感突變體酵母菌株CY162中表達TaHAK1-B基因,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因酵母在低鉀培養(yǎng)基上比轉(zhuǎn)空載體酵母長勢好,表明TaHAK1-B具有轉(zhuǎn)運鉀離子的功能。另外,將TaHAK1-B轉(zhuǎn)入鹽敏感突變體酵母菌株AXT3K中,在含鈉離子培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)基因酵母的長勢好于轉(zhuǎn)空載體酵母菌株的長勢,表明TaHAK1-B具有轉(zhuǎn)運鈉離子的功能。(6)構(gòu)建TaHAK1-B的超表達載體遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥,對轉(zhuǎn)基因植株進行表型分析。在含有3 mmol·L~-11 K~+的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因株系的根長明顯比野生型長,且側(cè)根較野生型多;在100μmol·L~-11 K~+的低鉀培養(yǎng)基上野生型幾乎不能正常生長,而轉(zhuǎn)基因擬南芥還能生長。這些結(jié)果表明TaHAK1-B可能在根的伸長和側(cè)根的發(fā)生中具有重要作用。
【圖文】：

基因的參與可以減小外界環(huán)境對自身的損害。從圖1-1 中可以看出，鉀離子通道蛋白和鉀轉(zhuǎn)運體在參與植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮著重要的作用，但是它們各自的表達部位、表達模式、亞細胞定位、離子選擇性和離子通透性又有差異[26]。植物體內(nèi)調(diào)控低鉀脅迫的路徑復(fù)雜而又精確，各個基因功能的發(fā)揮都離不開這一調(diào)控機制。

K/KUP/KT 家族蛋白結(jié)構(gòu)模型 (引用 Véry and Sentenac, KAK/KUP/KTpotassium transporters in plants(quote Véry an
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S512.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 朱蠡慶;王伯初;付雪;楊興艷;劉峻宇;孔靜;;膨壓在植物細胞生長中的作用[J];生物物理學(xué)報;2013年08期

2 秦余香;田延臣;王軍;韓璐;;小麥耐鹽相關(guān)基因TaHAK1的克隆與表達分析[J];麥類作物學(xué)報;2011年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 韓敏;鉀轉(zhuǎn)運體KUP7參與擬南芥響應(yīng)低鉀脅迫的功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 艾興輝;小麥轉(zhuǎn)運蛋白基因TaBASS2和TaHAK11的功能研究[D];山東大學(xué);2013年

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本文編號：2628041