【摘要】：Fused基因在動(dòng)物胚胎Hedgehog(Hh)信號(hào)通路和纖毛發(fā)生過(guò)程中有著重要作用,Fused基因最早在果蠅體節(jié)中發(fā)現(xiàn),參與果蠅胚胎發(fā)育中前后軸的區(qū)段體節(jié)極性的建立,并參與到果蠅Hedgehog(Hh)信號(hào)通路,而隨后在小鼠和斑馬魚研究中發(fā)現(xiàn)Fused具有參與運(yùn)動(dòng)纖毛中央對(duì)的建立的功能。雖然Fused功能在無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中被廣泛報(bào)道,但是Fused基因表達(dá)譜以及功能分析在文昌魚胚胎發(fā)育中都沒有任何研究。本文先通過(guò)原位雜交和實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)Fueed基因在不同時(shí)期的空間表達(dá)譜進(jìn)行系統(tǒng)的研究,隨后利用基因過(guò)表達(dá)和敲除2種方法研究文昌魚Fused基因與胚胎發(fā)育中Hedgehog(Hh)信號(hào)通路的關(guān)系。原位雜交及實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,Fused基因?yàn)槟冈葱员磉_(dá),并且在胚胎發(fā)育早期呈現(xiàn)全胚胎表達(dá)模式,隨著胚胎發(fā)育到3體節(jié)時(shí)期,Fused基因開始集中表達(dá)在文昌魚胚胎內(nèi)胚層。在過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,注射Fused全長(zhǎng)mRNA后并沒有觀察到任何胚胎發(fā)育異常的現(xiàn)象,并且原位雜交檢測(cè)文昌魚中Hh信號(hào)通路下游靶基因Ptch表達(dá)也未發(fā)生變化。對(duì)于這個(gè)結(jié)果可能是Fused激酶在Hh信號(hào)通路中參與suppressor of Fused(Sufu)磷酸化從而促進(jìn)Gli入核,而過(guò)量的Fused并不能使得suppressorofFused(Sufu)磷酸化增加,因此Gli入核程度變化不大,未能檢測(cè)到Hh信號(hào)通路上調(diào)的結(jié)果。本文篩選出已敲除Fused基因文昌魚F1,將相同移碼突變個(gè)體(缺失4bp)進(jìn)行自交,成功獲得含有Fused純合突變的F2代。原位雜交檢測(cè)F2后代胚胎發(fā)現(xiàn),在自交后代中有四分之一胚胎出現(xiàn)Fused基因表達(dá)消失現(xiàn)象,這暗示著我們獲得Fused基因敲除的文昌魚,而Hh信號(hào)通路下游靶基因Ptch在Fused-/-中卻沒有發(fā)生明顯變化,說(shuō)明Fused基因可能沒有參與文昌魚Hh通路。F2幼體個(gè)體基因型鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)后代中Fused+/+:Fuse+/-:Fused/-=l:2:1,符合孟德爾分離比,但是光學(xué)顯微鏡下觀察的Fused-/-個(gè)體卻沒有表現(xiàn)出和文昌魚Hh信號(hào)通路其他功能元件敲除突變體相類似的表型(如腦泡,眼點(diǎn),口,尾部器官變化的表型)。在隨后觀察中我們發(fā)現(xiàn)Fused-/-在胚后發(fā)育比相同培養(yǎng)條件下的Fuse+/+,Fused+/-緩慢,并且Fused/-在受精后3星期內(nèi)全部死亡。以上結(jié)果表明文昌魚Fused并沒有參與到Hh信號(hào)通路調(diào)控中去,但是Fused基因在文昌魚胚后3周正常發(fā)育中起到作用。為了確認(rèn)Fused基因是否參與文昌魚運(yùn)動(dòng)纖毛發(fā)生,我們通過(guò)免疫熒光和掃描電鏡對(duì)Fused/-中運(yùn)動(dòng)纖毛分布和長(zhǎng)度進(jìn)行細(xì)致的觀察。結(jié)果顯示,Fused/-中運(yùn)動(dòng)纖毛的分布和長(zhǎng)度與野生型并沒有顯著性差別�？紤]到Fused基因?yàn)槟冈葱员磉_(dá),母源性殘余的Fused蛋白可能對(duì)運(yùn)動(dòng)纖毛發(fā)生起相應(yīng)作用,所以我們通過(guò)高鹽處理脫去Fused-/-3體節(jié)期、8體節(jié)期、12體節(jié)期運(yùn)動(dòng)纖毛,并用掃描電鏡檢測(cè)運(yùn)動(dòng)纖毛在Fused-/-中再生的情況。但是掃描電鏡結(jié)果顯示,Fused/-中運(yùn)動(dòng)纖毛再生的情況與野生型中沒有顯著性差別。隨后我們?cè)诠鈱W(xué)顯微鏡下對(duì)幼體Fused--中運(yùn)動(dòng)纖毛的擺動(dòng)進(jìn)行觀察,也未發(fā)現(xiàn)與野生型有明顯區(qū)別。由上述結(jié)果我們推測(cè)Fused基因并未參與文昌魚中運(yùn)動(dòng)纖毛發(fā)生和功能發(fā)揮。2A肽介導(dǎo)的多基因表達(dá)載體具有高裂解活性、上下游基因等摩爾表達(dá)等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究。文昌魚作為一種新興的模式動(dòng)物,尚無(wú)應(yīng)用這種表達(dá)載體的報(bào)道,但已有的pCS2轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)在文昌魚中表達(dá)效率不高,我們?cè)趐XT7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)重新構(gòu)建一個(gè)由P2A(一種2A肽)介導(dǎo)的多基因表達(dá)載體。將體外轉(zhuǎn)錄的mRNA注入文昌魚胚胎后,經(jīng)過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)表明,由P2A介導(dǎo)的mRNA在文昌魚原腸胚中期即開始表達(dá),并且隨著胚胎發(fā)育表達(dá)量不斷上升。在胚胎發(fā)育至5體節(jié)期時(shí)我們能明顯觀察到eGFP蛋白被定位到細(xì)胞核中,而mCherry蛋白被定位到細(xì)胞膜上,說(shuō)明此時(shí)重組eGFP蛋白和mCherry蛋白已被完全剪切開。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)表明,在8體節(jié)時(shí)期由P2A介導(dǎo)的mRNA在文昌魚胚胎中剪切效率達(dá)到了 91%,說(shuō)明2A肽介導(dǎo)的多基因表達(dá)載體在文昌魚胚胎中具有高效的翻譯和剪切效率。進(jìn)而我們構(gòu)建了由文昌魚熱啟動(dòng)子(BbHsp70)啟動(dòng)的P2A多基因共表達(dá)載體,熱激證明其也能在文昌魚胚胎中表達(dá),并且能被剪切成兩個(gè)獨(dú)立的蛋白,達(dá)到了預(yù)期的效果。綜上,我們成功地構(gòu)建了一個(gè)在文昌魚中可用熱激啟動(dòng)表達(dá)、由P2A介導(dǎo)的多基因表達(dá)載體。
【圖文】：

圖１－１不同模式動(dòng)物中纖毛，Ｆｕｓｅｄ／Ｃｏｓ２，Ｈｈ信號(hào)通路的關(guān)系總結(jié)（引自Ｒｉｎｋ，２００９［＇１２］）逡逑Ｋｉｆ２７／ＩＣｉｆ７是Ｃｏｓ２的同源基因，圖中虛線表示尚未證實(shí)的推測(cè)結(jié)果，實(shí)線表示己得到逡逑．驗(yàn)證的結(jié)緝。逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋Ｓｕｍｍａｒｙ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｃｉｌｉａ，，邋Ｆｕｓｅｄ邋ａｎｄ邋Ｈｈ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｉｎ逡逑ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ａｎｉｍａｌ邋ｍｏｄｅｌ邋ｓｙｓｔｅｍｓ逡逑Ｋｉｆ２７／Ｋｉｆ７邋ｉｓ邋ｔｈｅ邋ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅ邋ｏｆ邋Ｃｏｓ２．邋Ｔｈｅ邋ｄｏｔｔｅｄ邋ｌｉｎｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｇｒａｐｈ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｔｈａｔ邋ｔｈｅ逡逑ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｈａｖｅ邋ｎｏｔ邋ｂｅｅｎ邋ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ，邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｓｏｌｉｄ邋ｌｉｎｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｔｈａｔ邋ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｈａｖｅ邋ｂｅｅｎ邋ｖｅｒｉｆｉｅｄ逡逑三２Ａ肽（Ｐ２Ａ）在多基因共表達(dá)的研究進(jìn)展逡逑１邋２Ａ肽的起源逡逑２Ａ肽于１９９１年在口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）中發(fā)現(xiàn)，是－？種２０個(gè)左右氨基酸逡逑組成可以自裂解為小片段肽。在ＦＭＤＶ中，２Ａ肽的剪切通過(guò)核糖體跳躍將自己逡逑的Ｃ－端自動(dòng)裂解，同時(shí)Ｎ－端被３Ｃ／３ＣＤ蛋白酶裂解后來(lái)的研究中發(fā)現(xiàn)，其逡逑

Ｈｈ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑Ｆｕ＆ｅｄ逡逑圖１－１不同模式動(dòng)物中纖毛，Ｆｕｓｅｄ／Ｃｏｓ２，Ｈｈ信號(hào)通路的關(guān)系總結(jié)（引自Ｒｉｎｋ，２００９［＇１２］）逡逑Ｋｉｆ２７／ＩＣｉｆ７是Ｃｏｓ２的同源基因，圖中虛線表示尚未證實(shí)的推測(cè)結(jié)果，實(shí)線表示己得到逡逑．驗(yàn)證的結(jié)緝。逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋Ｓｕｍｍａｒｙ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｃｉｌｉａ，邋Ｆｕｓｅｄ邋ａｎｄ邋Ｈｈ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｉｎ逡逑ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ａｎｉｍａｌ邋ｍｏｄｅｌ邋ｓｙｓｔｅｍｓ逡逑Ｋｉｆ２７／Ｋｉｆ７邋ｉｓ邋ｔｈｅ邋ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅ邋ｏｆ邋Ｃｏｓ２．邋Ｔｈｅ邋ｄｏｔｔｅｄ邋ｌｉｎｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｇｒａｐｈ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｔｈａｔ邋ｔｈｅ逡逑ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｈａｖｅ邋ｎｏｔ邋ｂｅｅｎ邋ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ，邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｓｏｌｉｄ邋ｌｉｎｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｔｈａｔ邋ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｈａｖｅ邋ｂｅｅｎ邋ｖｅｒｉｆｉｅｄ逡逑三２Ａ肽（Ｐ２Ａ）在多基因共表達(dá)的研究進(jìn)展逡逑１邋２Ａ肽的起源逡逑２Ａ肽于１９９１年在口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）中發(fā)現(xiàn)，是－？種２０個(gè)左右氨基酸逡逑組成可以自裂解為小片段肽。在ＦＭＤＶ中，２Ａ肽的剪切通過(guò)核糖體跳躍將自己逡逑的Ｃ－端自動(dòng)裂解
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王慧;李光;王義權(quán);;文昌魚Hedgehog基因敲除和突變體表型分析[J];遺傳;2015年10期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 張秋金;廈門海域文昌魚屬Branchiostoma的分類及2種文昌魚的實(shí)驗(yàn)室連續(xù)繁育[D];廈門大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2627061