【摘要】：雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育和功能的維持依賴許多基因的協(xié)同作用。這些基因在雄性生殖系統(tǒng)中表達并發(fā)揮功能,它們的突變可能影響睪丸的發(fā)育及精子的成熟,并最終導致育性的變化。隨著生殖生物學研究的進展,已有很多基因功能得到深入研究但仍有許多基因的具體功能和作用機制未知。對這些基因功能的研究有助于人們了解精子發(fā)生機制并為診斷和治療不育癥提供理論基礎。近年來,隨著CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9(CRISPR-associated protein 9)基因編輯技術(shù)的成熟,簡捷、高效、精準的基因編輯在越來越多的生物體中得以實施,其中就包括黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)這一經(jīng)典的基因功能研究模型。利用CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合同源定向修復(Homology Directed Repair,HDR)策略對果蠅基因組進行編輯,可以根據(jù)設計敲除目的基因或引入分子修飾。為研究果蠅睪丸基因在雄性生殖中的功能,本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合HDR在果蠅中對候選基因逐一進行敲除,建立純合的突變果蠅品系,并對獲得的突變體進行生殖表型的初步分析,以期望進一步開展基因相關功能的研究。我們依據(jù)數(shù)據(jù)庫信息,按照睪丸中表達、與人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)基因高度同源、雄性生殖方面功能尚未見報道這三個標準進行了篩選,最終確定8個候選基因(CG4161、CG11475、CG2921、CG10541、CG7276、CG3800、CG8117和CG16779)進行研究。首先,我們通過RT-PCR對這些基因在果蠅和小鼠不同組織中的表達水平進行了檢測,對數(shù)據(jù)庫中的結(jié)果進行了驗證。其次,針對這些基因的結(jié)構(gòu)和序列,分別設計構(gòu)建sgRNA質(zhì)粒及帶有紅色熒光標記的供體模板質(zhì)粒,利用顯微注射導入表達有Cas9蛋白的果蠅胚胎中,通過對后代進行熒光標記篩選,得到基因敲除候選果蠅,并對候選果蠅進行了分子鑒定,最終獲得純合突變體品系。再次,為檢測這些基因在雄性生殖中的作用,我們對8個敲除品系的雄蠅進行了生育力測試,結(jié)果顯示CG3800~(-/-)和CG7276~(-/-)雄蠅部分不育,且可育果蠅后代數(shù)量較野生型顯著下降,而其它基因敲除突變體育性正常,后代數(shù)量與野生型無顯著差異。最后,我們還對這些突變體進行了細胞學分析。睪丸解剖觀察顯示CG3800~(-/-)和CG7276~(-/-)不育雄蠅出現(xiàn)不同程度精囊縮小、精原干細胞減少和細胞分布混亂,而其他突變體雄蠅成熟精子數(shù)量充足。染色結(jié)果也提示部分CG3800~(-/-)和CG7276~(-/-)雄蠅出現(xiàn)個性化復合體(individualization complex,IC)不同步及精子散亂等現(xiàn)象。這些突變體的獲得及表型的初步分析為進一步研究基因功能及機制提供了良好的動物模型及基礎。
【圖文】：

21圖 1-1 No.92 pGX-attP-DsRed 質(zhì)粒圖譜5’和 3’同源臂分別與目的基因 5’切割位點和 3’切割位點相接，以野生型果 w1118基因組 DNA 為模板，PCR 擴增長度約 2.4kb 的同源臂片段，5’和 3’片段分別添加 20bp 包含 EcoRI 和 NheI 及 SpeI 和 XhoI 酶切位點的與載體一致的同序列，使用單片段同源重組試劑盒（諾維贊生物科技有限公司，南京），將 5’源臂連接到用限制性內(nèi)切酶 EcoRI、NheI（New England Biolabs，美國）酶切載體上，獲得的質(zhì)粒測序正確后再用 SpeI 和 XhoI 雙酶切，與 3’同源臂連接，，序正確后得到供體 DNA 質(zhì)粒（圖 1-2）。

CG4161供體質(zhì)粒構(gòu)建示意圖
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q492;Q78

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 Jiang Xu;Xingjie Ren;Jin Sun;Xia Wang;Huan-Huan Qiao;Bo-Wen Xu;Lu-Ping Liu;Jian-Quan Ni;;A Toolkit of CRISPR-Based Genome Editing Systems in Drosophila[J];Journal of Genetics and Genomics;2015年04期

2 Andrew R.Bassett;Ji-Long Liu;;CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila[J];Journal of Genetics and Genomics;2014年01期

3 Da Liu;Zhanxiang Wang;An Xiao;Yutian Zhang;Wenyuan Li;Yao Zu;Shaohua Yao;Shuo Lin;Bo Zhang;;Efficient Gene Targeting in Zebrafish Mediated by a Zebrafish-Codon-Optimized Cas9 and Evaluation of Off-Targeting Effect[J];Journal of Genetics and Genomics;2014年01期

4 Chuanxian Wei;Jiyong Liu;Zhongsheng Yu;Bo Zhang;Guanjun Gao;Renjie Jiao;;TALEN or Cas9-Rapid,Efficient and Specific Choices for Genome Modifications[J];Journal of Genetics and Genomics;2013年06期

本文編號：2625899