【摘要】：靈芝酸是一種靈芝生產(chǎn)的高度氧化的羊毛甾醇類衍生物,它具有抗癌、抗HIV等重要的藥理學(xué)活性。目前靈芝酸生物合成途徑仍未完全清楚,尤其是從中間代謝產(chǎn)物羊毛甾醇骨架修飾到形成靈芝酸的過程。研究表明,細(xì)胞色素P450可能參與了羊毛甾醇的修飾過程。目前僅發(fā)現(xiàn)cyp5150l8參與羊毛甾醇骨架C-26位羧基的形成,而其它相關(guān)的P450基因仍未清楚。本文首先研究了靈芝在靈芝酸高產(chǎn)/低產(chǎn)(液體靜置/振蕩)培養(yǎng)條件下的差異表達(dá)基因,發(fā)現(xiàn)共有3321個基因表達(dá)上調(diào)。對上調(diào)基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)含有可能與類固醇結(jié)合的CYP512和CYP5144家族P450基因,結(jié)合文獻(xiàn)分析,我們從中篩選出了10個與羊毛甾醇合酶基因lss表達(dá)正相關(guān)的CYP512和CYP5144家族P450基因。通過熒光定量PCR分析了所獲得的10個P450基因在靈芝液體靜置/振蕩培養(yǎng)方式下的表達(dá)量,結(jié)果表明5個P450基因cyp512a3,cyp512a11,cyp5144n1,cyp512u4和cyp512v2在液體靜置培養(yǎng)條件下的表達(dá)量分別是振蕩培養(yǎng)條件下表達(dá)量的7.2,3.7,3.4,89.8和63.4倍。我們分析了這5個P450基因在液體靜置/振蕩動態(tài)培養(yǎng)條件下的表達(dá)量與靈芝酸T積累的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)cyp512v2和cyp512a3的表達(dá)量與靈芝酸T的含量正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.954和0.992,p值分別為0.046和0.008;進(jìn)一步研究了這5個P450基因在不同培養(yǎng)(液體振蕩、液體靜置、靜置鈣離子添加、靜置氮缺陷)方式下的表達(dá)量與靈芝酸T含量的相關(guān)性,結(jié)果顯示cyp512v2的表達(dá)量與靈芝酸T的含量正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.992,p值為0.008。在靈芝細(xì)胞內(nèi)對cyp512v2基因進(jìn)行了基因沉默,獲得了9株沉默菌株,基因組PCR驗(yàn)證結(jié)果表明沉默載體成功整合入沉默菌株中,熒光定量測定9株沉默菌株中cyp512v2基因的表達(dá)量分別被抑制了52%,75%,76%,27%,3%,36%,23%和49%。挑選了沉默效率較高的3株基因沉默菌株進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵,結(jié)果顯示3株沉默菌株內(nèi)靈芝酸T的含量分別比野生型菌株的含量降低了13%,69%和66%,結(jié)果暗示cyp512v2可能參與了靈芝酸T的生物合成。本研究獲得了可能參與靈芝酸生物合成的候選P450基因cyp512v2,進(jìn)一步通過酵母異源表達(dá)及在靈芝細(xì)胞內(nèi)對cyp512v2基因進(jìn)行缺失、回補(bǔ)等方法將明確其在靈芝酸生物合成途徑中的作用。本研究對深入了解靈芝酸的生物合成和代謝調(diào)控具有重要的意義。
【圖文】：

FPP 在鯊烯合酶 squalene synthase(SQS)的催化下單加氧酶的作用產(chǎn)生鯊烯 2, 3-氧化物，再經(jīng)過羊毛甾甾醇。最后通過不同酶的修飾作用產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的靈通過同位素標(biāo)記驗(yàn)證了羊毛甾醇可以轉(zhuǎn)化為靈芝酸，步驟還是不清楚的，近年來相關(guān)的研究表明細(xì)胞色素后修飾（骨架的氧化和羥化）形成靈芝酸的過程[49-5徑中有幾個步驟是非常關(guān)鍵的，3-羥基-3-甲基戊二酰R)催化類異戊二烯生物合成的第一步反應(yīng)，鯊烯合成成固醇和三萜的第一步酶反應(yīng)，，羊毛甾醇合成酶(L酸的骨架結(jié)構(gòu)羊毛甾醇。目前靈芝酸生物合成上游途酶，倍半萜合成酶 FPS 和鯊烯合成酶 SQS 和羊毛甾2]。

液體靜 8.45 g/蕩培養(yǎng) T 含量靜置培養(yǎng)條/L (干重，養(yǎng)下，分別為量是液體振蕩條件和液體振DW)。靈芝為 254.67 和蕩培養(yǎng)條件振蕩培養(yǎng)條芝酸 T 的含15.76 μg/件下的 17 倍條件下細(xì)胞量含量在液體靜/100 mg DW倍。昆明量無顯著性靜置培養(yǎng)條W。液體靜明理工大學(xué)碩士性差別，分別條件下遠(yuǎn)遠(yuǎn)高靜置培養(yǎng)條件士學(xué)別高件
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S567.31;TQ920.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 尚衛(wèi)輝;李永濤;舒薇;M.Benedetti;;P450酶系對污染物的生物指示和催化降解機(jī)制[J];環(huán)境科學(xué)與技術(shù);2009年06期

2 陳偉強(qiáng),羅少洪,李紅枝,楊紅;靈芝多糖對高脂血癥大鼠血脂及脂質(zhì)過氧化的影響[J];中國中藥雜志;2005年17期

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1 徐軍偉;靈芝細(xì)胞在液體靜置培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)中單體靈芝酸的生產(chǎn)及差異表達(dá)基因的鑒定[D];華東理工大學(xué);2009年

本文編號：2624988