【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是生物體內(nèi)一類非編碼小RNA分子,長度約為21-24個堿基,主要通過對靶基因mRNA的翻譯抑制、降解等負調(diào)控的方式在轉(zhuǎn)錄后水平精確有效地調(diào)控基因的表達。植物miRNA能響應(yīng)干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫,在植物抗逆過程中發(fā)揮重要作用。各種逆境條件會對桑樹的生長造成重大影響,研究桑樹(Morus alba L.)一些重要的miRNA及其靶基因的功能和它們在脅迫條件下的生理生化、分子適應(yīng)機制,對提高桑樹的抗逆性、保存桑樹種質(zhì)資源和提高桑樹產(chǎn)量有重要作用,同時為利用桑樹作為生態(tài)林樹種各方面的作用提供科學支撐。本研究通過高通量深度降解組測序技術(shù)系統(tǒng)全面的鑒定了桑樹耐旱關(guān)聯(lián)miRNA及其靶基因,通過瞬時轉(zhuǎn)化及VIGS等方法對篩選出的關(guān)鍵miRNA及靶基因的抗旱功能進行了分析,探究了桑樹耐旱的分子機制,主要的研究結(jié)果如下:一、利用高通量深度降解組測序技術(shù)鑒定桑樹耐旱關(guān)聯(lián)miRNA及其靶基因通過桑樹深度高通量降解組測序,在對照文庫(CL)中,分別鑒定出30個保守miRNA家族的409個靶基因和199個新miRNA的990個靶基因,在干旱文庫(DL)中,分別鑒定出30個保守miRNA家族的373個靶基因和195個新miRNA的950個靶基因。DL保守miRNA家族中,miR156、miR172和miR396家族靶向最多數(shù)量的靶基因,推測這3個保守miRNA家族在桑樹響應(yīng)干旱脅迫中可能起到重要作用。通過分析miRNA-target分子網(wǎng)絡(luò)圖,我們發(fā)現(xiàn)在DL特有網(wǎng)絡(luò)圖中,有838個miRNA-mRNA pairs,占DL中總miRNA-mRNA pairs的63.34%。利用熒光定量PCR檢測了11個靶基因和12個miRNA在干旱脅迫下的表達模式。通過RLM-5’RACE驗證了6個靶基因的剪切位點,證明降解組測序得出的結(jié)果是非常準確的。GO注釋和KEGG通路分析表明這些靶基因參加廣泛的生物過程和各種代謝途徑。二、桑樹miR166f瞬時轉(zhuǎn)化過表達鑒定其抗旱功能獲得了桑樹miR166f的前體序列,發(fā)現(xiàn)成熟體miR166f在前體的3’臂上,miR166f前體序列最小折疊自由能(MEFs)為-51.70 kcal/mol,具有典型的植物miRNA前體二級結(jié)構(gòu)特征;miR166f 5’端上游除了包含典型的具有轉(zhuǎn)錄起始功能的TATA-box和CAAT-box外,還含有多個脅迫響應(yīng)順式作用元件和一些激素響應(yīng)元件;建立了桑樹miR166f瞬時轉(zhuǎn)化體系,當轉(zhuǎn)化液濃度OD_(600)為0.7、瞬時轉(zhuǎn)化4 d時,葉片GUS組織化學染色效果最好,同時該處理條件下,葉片中GUS基因和miR166f的表達量與對照葉片中的表達量相比積累最顯著,說明適宜濃度的轉(zhuǎn)化液對瞬時轉(zhuǎn)化效率有較大影響和農(nóng)桿菌介導的瞬時轉(zhuǎn)化有一定的時效性;在桑樹中用不同濃度的轉(zhuǎn)化液瞬時轉(zhuǎn)化過表達miR166f后,與對照處理相比,miR166f的2個HD-Zip靶基因和1個JMJD6靶基因的表達水平均出現(xiàn)顯著下降;同時葉片相對含水量(RWC)、可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性和Pro含量含量均出現(xiàn)不同程度的增加,而MDA含量顯著降低。結(jié)果表明miR166f在桑樹的抗逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮積極作用。三、桑樹shabby-related蛋白激酶(MmSK)基因的克隆、表達分析及原核表達克隆獲得包括完整ORF的MmSK基因(GenBank No:KY348867),其cDNA序列長為1705 bp,編碼411個氨基酸殘基,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為46.55 Kd,等電點為8.61。保守域結(jié)構(gòu)分析表明,MmSK蛋白具有明顯的蛋白激酶的結(jié)構(gòu)域,屬于植物類GSK3/shaggy蛋白激酶家族。通過多重序列比對和進化樹分析發(fā)現(xiàn),MmSK基因的氨基酸序列與其他比對間的同源性均在89%以上。實時熒光定量PCR分析表明,在桑樹不同組織中MmSK基因的相對表達量有較大差異,暗示著MmSK可能參與了植物器官發(fā)育的調(diào)控,其中,MmSK在韌皮部中表達量最高。桑MmSK基因在高鹽、干旱、低溫和ABA處理等不同非生物脅迫處理下均上調(diào)表達,表明該基因參與了桑樹的抗逆過程,為更好地了解MmSK基因在桑樹響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮的作用及分子機制打下了基礎(chǔ)。構(gòu)建了魯桑MmSK基因的原核表達載體pET-28a(+)-MmSK,并在大腸桿菌BL21中成功誘導表達重組蛋白MmSK。四、桑樹VIGS體系的建立及MmSK基因抗旱功能鑒定利用八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,PDS)基因作為報告基因,構(gòu)建桑樹VIGS體系,并利用VIGS技術(shù)成功將桑樹miR172的靶基因--MmSK基因沉默。MmSK基因沉默后,其在pTRV2-MmSK-VIGS植株的表達量僅為空載pTRV2-00陰性對照組植株的34.02%,差異極顯著。在桑樹中沉默MmSK基因后,葉片中可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性、Pro含量均出現(xiàn)不同程度的降低,而MDA的含量增加顯著。在干旱脅迫下,隨著干旱脅迫處理時間的延長,葉片中可溶性蛋白含量、Pro含量和MDA含量均逐漸增加,SOD活性和POD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在第5 d時,達到最大值,與MmSK基因表達量變化趨勢一致。表明桑樹MmSK基因沉默后,能引起桑樹中一些與抗旱相關(guān)的酶類活性和代謝物的含量的降低,從而導致其抗旱性能減弱,進一步說明MmSK基因在桑樹的干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究通過干旱脅迫桑樹降解組高通量測序篩選桑樹耐旱關(guān)聯(lián)miRNA和靶基因,分析候選miRNA和靶基因的時空表達特性,通過瞬時轉(zhuǎn)化過表達研究目標miR166f對靶基因表達的調(diào)控和對植株抗旱相關(guān)生理生化指標的影響;構(gòu)建了桑樹VIGS轉(zhuǎn)化體系,并通過VIGS法鑒定MmSK基因的抗旱功能。研究結(jié)果完善了桑樹抗旱的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為桑樹抗逆機理研究及抗性品種選育提供重要的理論依據(jù)和探索途徑。
【圖文】：

圖 1.1 干旱類型[10]Fig.1.1 Classification of drought1.1.1.2 干旱對植物的影響和危害干早對植物有非常廣泛而深刻的影響和危害，會表現(xiàn)在萌發(fā)、營養(yǎng)和生殖生長等生長發(fā)育的各階段及光合、呼吸作用、營養(yǎng)吸收和酶活力等具體的生理代謝過程[5,6]。植物受到缺水脅迫時，葉片和莖基幼嫩部會出現(xiàn)下垂的萎蔫現(xiàn)象。當干旱脅迫時間過長，植物由適應(yīng)性萎蔫轉(zhuǎn)為永久性萎蔫，就可能造成植物死亡。干旱對植物的影響和危害主要體現(xiàn)在以下幾個方面。1.1.1.2.1 抑制植物生長發(fā)育水分虧缺能夠改變細胞壁的伸展性能，如小麥、大豆、玉米等植物在水分虧缺下由于生長受到抑制，其細胞壁的伸展程度明顯降低，胞壁物質(zhì)在植物延伸生長中起到關(guān)鍵作用[13,14]。王晨陽[8]研究發(fā)現(xiàn)，土壤水分不足會抑制植株各莖節(jié)間活動，遲緩莖節(jié)生長，降低株高，隨著干旱脅迫程度的加劇，各位葉的長度及葉面積減少，且其長/寬比值也減小。

江蘇科技大學農(nóng)學博士學位論文 ；干旱脅迫進一步加劇時，葉片水勢下降到一定值后，光合速率大幅度下降旱脅迫的繼續(xù)加劇，光合作用會部分或完全受到抑制，植物就會面臨死亡。迫下，，葉綠素、核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)遭到破壞，生物膜結(jié)構(gòu)被損傷，喪失，進而改變了植物一系列生理生化功能，這可能是導致光合活性降低的。干旱脅迫下葉綠體膨脹，排列紊亂，類囊體層腫脹或解體，光合器官的超微破壞[34]。干旱脅迫可導致煙株體內(nèi)活性氧的積累、葉綠素含量下降，凈光合，而呼吸速率則先升后降[35]。干旱缺水時會導致植物葉片氣孔開度減小甚至，阻礙植物對 CO2的吸收，導致光合作用下降[36]。干早條件還會限制很多光過程。水分虧缺導致細胞內(nèi)過多地積累活性氧，引發(fā)膜脂過氧化自由基鏈式使生物膜結(jié)構(gòu)遭到破壞[25]。
【學位授予單位】：江蘇科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S888.2

【參考文獻】

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