【摘要】：對(duì)生活在極端寒冷環(huán)境下的魚類而言,一個(gè)極其重要的問題就是如何避免受到寒冷環(huán)境的傷害。南極魚魚類之所以能在南極極端寒冷環(huán)境下生存,并成為南極海域主要的魚類物種,其原因非常值得探究。我們先前使用轉(zhuǎn)錄組和比較基因組學(xué)分析研究發(fā)現(xiàn):在南極魚(Dissostichus mawsoni,D.mawsoni)魚類進(jìn)化發(fā)育中selenoprotein P的基因拷貝數(shù)發(fā)生了顯著擴(kuò)增,表明南極魚selenoprotein P(Dm-SEPP)有助于南極魚在極端寒冷環(huán)境中的生存,但是該基因的結(jié)構(gòu)和功能未知。本研究對(duì)從南極魚D.mawsoni c DNA文庫(kù)中克隆得到的南極魚Dm-SEPP基因進(jìn)行c DNA結(jié)構(gòu)和功能分析,并探究了其在低溫下的響應(yīng)機(jī)制。具體結(jié)果如下:(1)使用SECISearch3預(yù)測(cè),在其3’-UTR區(qū)中存在兩個(gè)SECIS元件,分別是1427-1502 bp和2001-2074 bp;計(jì)算得其等電點(diǎn)PI為5.68,分子量為40.96k Da;該序列在ORF區(qū)包含17個(gè)硒半胱氨酸U,硒半胱氨酸密碼子的模式為UXU或UXUXU,U代表硒半胱氨酸,X代表任意氨基酸。將南極魚、斑馬魚及哺乳動(dòng)物人類的SEPP的m RNA結(jié)構(gòu)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)比對(duì),結(jié)果發(fā)現(xiàn):這三個(gè)物種的SEPP中SECIS元件具有保守性,且其m RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)具有共同模式:AUGA_AA_GA。(2)將南極魚與其他物種的SEPP氨基酸序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)南極魚與河豚或尼羅羅非魚的SEPP氨基酸相似度高達(dá)63%,大多數(shù)U是保守的,南極魚Dm-SEPP包含17個(gè)U。在MEGA 5.05軟件中使用UPGMA方法構(gòu)建進(jìn)化樹,結(jié)果表明南極魚Dm-SEPP與河豚的最接近,模式生物中斑馬魚的最接近于南極魚的Dm-SEPP。(3)通過Xho I和臨近Eco RI兩個(gè)酶切位點(diǎn)將南極魚Dm-SEPP的c DNA(包括ORF和3’-UTR)克隆入pcDNA3.1(-)載體中;為方便監(jiān)測(cè),在其cDNA終止密碼子(TAG)前插入FLAG標(biāo)簽并進(jìn)行種間密碼子優(yōu)化。將構(gòu)建好的Dm-SEPP-FLAG重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人胚胎腎細(xì)胞HEK-293T中,然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行低溫28°C處理,Western Blot及RT-q PCR表明Dm-SEPP在HEK-293T細(xì)胞中成功表達(dá),且低溫處理下Dm-SEPP表達(dá)量增加;流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)及臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果表明低溫處理下過表達(dá)Dm-SEPP的HEK-293T細(xì)胞比對(duì)照組ROS顯著降低且存活率明顯升高。所以,南極魚Dm-SEPP在低溫下通過抑制ROS引起的損傷而保護(hù)細(xì)胞。(4)將斑馬魚成纖維細(xì)胞ZF4細(xì)胞進(jìn)行低溫18°C處理3,5,30天后,收集蛋白監(jiān)測(cè)低溫下ZF4細(xì)胞內(nèi)源性Em-SEPP的表達(dá),Western Blot及RT-q PCR結(jié)果均表明:低溫短期處理3天,Em-SEPP表達(dá)量明顯增加;通過構(gòu)建sh RNA慢病毒質(zhì)粒對(duì)ZF4細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)源性Em-SEPP敲降,低溫18°C處理24小時(shí)后,監(jiān)測(cè)其ROS及細(xì)胞存活率,結(jié)果表明:ZF4細(xì)胞內(nèi)源性Em-SEPP敲降后ROS升高,存活率降低,且低溫處理后ROS升高得更明顯,細(xì)胞存活率降低得更明顯。總而言之,本研究通過在293T細(xì)胞中過表達(dá)南極魚Dm-SEPP探究其在南極魚寒冷適應(yīng)中的作用;為揭示其在魚類寒冷適應(yīng)中的作用,以斑馬魚ZF4細(xì)胞為例,研究發(fā)現(xiàn)低溫能誘導(dǎo)ZF4細(xì)胞中Em-SEPP表達(dá)增高,ZF4細(xì)胞中內(nèi)源性Em-SEPP敲降同時(shí)表明低溫下SEPP通過調(diào)控ROS水平對(duì)細(xì)胞存活率造成影響,揭示了低溫下SEPP表達(dá)增加對(duì)細(xì)胞存活的保護(hù)作用。這些數(shù)據(jù)表明硒蛋白SEPP的表達(dá)也許是低溫下魚類存活的一個(gè)普遍的保護(hù)機(jī)制。
【圖文】：

南大洋及南極環(huán)流Fig.1.1TheSouthernOceananditsoceanographiccurrentsystemsurroundingAntarctica.

圖 1.2 鱸形類亞目的進(jìn)化分布Fig. 1.2 Phylogenetic distribution of the perciform suborderNotothenioidei.期寒冷水域中的生存適應(yīng)性變化
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2625159