【摘要】：紅細(xì)胞是血液中主要的和含量最多的細(xì)胞,在氧氣運(yùn)輸和免疫過程中起著的重要作用。目前,臨床用血主要依賴于社會(huì)無償獻(xiàn)血,這種血液來源的渠道是不穩(wěn)定的,而且還存在安全性問題。用干細(xì)胞向紅細(xì)胞誘導(dǎo)的方法,在人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞上有理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),但是,因?yàn)檎T導(dǎo)效率很低導(dǎo)致制備成本很高。此外,還存在倫理和安全性的問題,從而限制干細(xì)胞在紅細(xì)胞誘導(dǎo)領(lǐng)域的進(jìn)一步運(yùn)用。人臍帶來源的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,作為機(jī)體的成體干細(xì)胞,不存在倫理和安全性問題,是一種很好的初始細(xì)胞。研究顯示敲除或抑制SH2B3基因的表達(dá),可以提高干細(xì)胞向紅細(xì)胞誘導(dǎo)的效率。本研究利用CRISPR/Cas9對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行基因編輯,針對(duì)原代細(xì)胞的特點(diǎn),設(shè)計(jì)了通過CRISPR/Cas9技術(shù)和雙抗性雙熒光基因介導(dǎo)同源重組插入敲除目的基因的策略,用于敲除人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)的SH2B3基因,為建立一種高效率的將人成體干細(xì)胞誘導(dǎo)獲得成熟紅細(xì)胞的方法打基礎(chǔ)。本研究結(jié)果如下:1.構(gòu)建了敲除載體和同源重組篩選載體以pX330載體為骨架載體,構(gòu)建了能夠共表達(dá)具有核定位信號(hào)的Cas9蛋白和靶向SH2B3基因第五外顯子的sgRNA的敲除載體pSH2B3-KO。利用多種分子克隆技術(shù),完成了同源重組篩選載體pTGP多個(gè)元件的拼接。并進(jìn)一步完成同源重組篩選載體pTMN、pTMP、pTEGP、pTEMN和pTEMP等的構(gòu)建。2.CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的同源重組插入敲除體系的驗(yàn)證在人的293細(xì)胞中,初步證明了上述所構(gòu)建的篩選載體能夠正常工作,在熒光顯微鏡下,能觀察到相應(yīng)的熒光信號(hào)。然后,對(duì)共轉(zhuǎn)染pSH2B3-KO和pTGP載體的293細(xì)胞進(jìn)行了為期四周的藥物篩選。分別在細(xì)胞水平和分子水平證明,CRISPR/Cas9技術(shù)和篩選基因介導(dǎo)的同源重組插入敲除SH2B3基因的方法是可行的。從而能夠通過熒光信號(hào)或藥物處理篩選出目的敲除類型的細(xì)胞,免去有限稀釋分單克隆方法的繁瑣和長(zhǎng)耗時(shí)的實(shí)驗(yàn)操作。3.用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除SH2B3基因用上述CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的同源重組插入敲除體系處理人HeLa細(xì)胞,加嘌呤霉素和新霉素篩篩選兩周后,將細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法分離獲得19株單克隆細(xì)胞。提取基因組DNA和總RNA進(jìn)行PCR和RT-PCR鑒定分析。PCR結(jié)果顯示,100%的細(xì)胞都檢測(cè)到了篩選元件的插入。其中89.5%的細(xì)胞克隆雙靶位點(diǎn)被破壞或插入篩選片段,57.9%的細(xì)胞克隆發(fā)生了雙插入敲除,42.1%的發(fā)生單插入敲除。測(cè)序和RT-PCR檢測(cè)的結(jié)果證明,篩選元件已經(jīng)準(zhǔn)確整合到基因組上,并能進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)到篩選元件的整合。將同源重組插入敲除SH2B3基因的策略,初步運(yùn)用到原代細(xì)胞人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí),通過電轉(zhuǎn)染法,電轉(zhuǎn)染效率能達(dá)到30%左右。因?yàn)樗幬锖Y選后獲得的轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖能力不足,目前尚未在原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞上篩選建立SH2B3基因敲除細(xì)胞系。還需對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的藥物篩選濃度及恢復(fù)條件進(jìn)行優(yōu)化。
【圖文】：

3-1 敲除載體 pSH2B3-KO 和拼接位點(diǎn)序列示ting vector pSH2B3-KO and the targeted sit（實(shí)驗(yàn)步驟參考說明書）獲得 293 細(xì)胞 DNA 為模板，進(jìn)行巢式 PCR，，先通過引共 4 098 bp 的基因組 DNA 序列。以該 上游臂（U, 5，臂, 1 449 bp）（圖3-2A）；通m, 701 bp）產(chǎn)物（圖 3-2B）。

引物SH2B3-5’臂，PCR獲得上游臂（U, 5，臂, 1 449 bp）（圖3-2A）；通過引物SH2B3-3’arm，PCR 獲得下游臂（D, 3’arm, 701 bp）產(chǎn)物（圖 3-2B）。圖 3-2 巢式 PCR 產(chǎn)物電泳。（A）上游臂；（B）下游臂Fig. 3-2 Electrophoresis of nested PCR products.（A）Upstream homologous arm;（B）Downstreamhomologous arm以載體 pcDNA-3.1 為模板，引物 CMV-bGH，通過 PCR 在 CMV-bGH 兩端分別引入兩個(gè)同方向的 loxP 位點(diǎn)，獲得‘loxP-CMV-bGH-loxP’片段（C, 685 bp）（圖 3-3）。圖 3-3 PCR 產(chǎn)物‘C’瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 3-3 Agarose gel electrophoresis results of the PCR products of DNA fragment ‘C’以載體 pCDH-gp 為模板，通過引物 copGFP-PuroR，PCR 獲得‘copGFP-T2A-PuroR’片段（GP, 1 469 bp）（圖 3-4）。圖 3-4
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2624788