【摘要】：昆蟲表皮是其適應(yīng)環(huán)境的保護(hù)性屏障,表皮脂是表皮的重要組成成分,可以避免昆蟲體內(nèi)水分蒸發(fā)和防止外源物質(zhì)侵入。昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育離不開表皮周而復(fù)始的蛻去和形成,表皮脂的形成對(duì)維持表皮結(jié)構(gòu)完整性至關(guān)重要。表皮脂形成關(guān)鍵基因的篩選及功能研究將揭示表皮脂形成的分子機(jī)制,具有重要的理論與實(shí)踐意義。本文以飛蝗Locusta migratoria為研究對(duì)象,基于飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫搜索相關(guān)基因,利用RNAi技術(shù)(RNA interference,RNAi)結(jié)合相關(guān)檢測(cè)方法,探討脂合成和轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵基因在飛蝗表皮脂形成過程中的生物學(xué)功能。主要研究結(jié)果如下:一、飛蝗乙酰輔酶A羧化酶(ACC)基因鑒定與功能研究乙酰輔酶A羧化酶是脂肪酸合成過程中的限速酶�；陲w蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,搜索獲得1條ACC基因序列。該基因編碼的蛋白,其催化功能區(qū)包括生物素羧化酶(BC)、生物素羧基載體蛋白(BCCP)和羧基轉(zhuǎn)移酶(CT)。飛蝗5齡期發(fā)育階段RT-qPCR表達(dá)分析結(jié)果顯示,LmACC在蛻皮后前3天表達(dá)量較高;組織表達(dá)分析結(jié)果顯示,LmACC在脂肪體和體壁高表達(dá);細(xì)胞組織定位結(jié)果顯示,LmACC定位于脂肪體和絳色細(xì)胞;采用RNAi技術(shù),有效沉默LmACC表達(dá)后發(fā)現(xiàn),部分若蟲出現(xiàn)蛻皮困難致死表型,而成功蛻皮至下一齡期的若蟲則出現(xiàn)陸續(xù)死亡的表型;中性脂熒光染料Bodipy~(505/515)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),脂類物質(zhì)以脂滴形式主要分布在脂肪體中,與dsGFP-注射組若蟲相比,dsLmACC-注射組若蟲體內(nèi)脂滴的熒光強(qiáng)度較弱,表明體內(nèi)中性脂含量減少;表皮超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示,抑制LmACC表達(dá)后,原表皮中孔道的物質(zhì)含量與對(duì)照組相比無明顯差異;采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測(cè)分析表皮碳?xì)浠衔?cuticular hydrocarbon,CHC)含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),dsLmACC-注射組若蟲的CHC含量減少了38.8%。綜上所述,LmACC參與飛蝗體內(nèi)脂類物質(zhì)合成,沉默該基因后影響表皮碳?xì)浠衔锏暮铣闪�。二、飛蝗細(xì)胞色素P450 CYP4G家族基因鑒定與功能研究細(xì)胞色素P450 CYP4G亞家族是昆蟲特有且高度保守的基因�；陲w蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,獲得兩條CYP4G基因cDNA序列,由P450國(guó)際命名委員會(huì)命名為L(zhǎng)mCYP4G62和LmCYP4G102。LmCYP4Gs具有一系列細(xì)胞色素P450 CYP4G亞家族基因的特征序列和保守結(jié)構(gòu)域。LmCYP4Gs在飛蝗5齡期發(fā)育階段的表達(dá)結(jié)果表明,LmCYP4G62在5齡中期表達(dá)量較高,而LmCYP4G102在5齡期持續(xù)高表達(dá)。組織部位表達(dá)分析結(jié)果表明,LmCYP4G62和LmCYP4G102均在體壁高表達(dá),脂肪體中次之,其他組織部位基本不表達(dá);原位雜交結(jié)果發(fā)現(xiàn),LmCYP4G62和LmCYP4G102均特異地存在于絳色細(xì)胞中。采用RNAi技術(shù),有效沉默靶基因表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),dsLmCYP4G62-注射組若蟲均可成功蛻皮至下一齡期,能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育;dsLmCYP4G102-注射組若蟲在順利蛻皮至下一齡期后,體重在短時(shí)間內(nèi)迅速減輕,出現(xiàn)表皮皺縮易碎表型,死亡率為100%,而高濕環(huán)境可緩解該死亡表型;透射電鏡結(jié)果顯示,抑制LmCYP4G102表達(dá)后,原表皮中孔道的物質(zhì)含量與對(duì)照組相比無明顯差異;CHC含量檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,dsLmCYP4G62-注射組若蟲CHC含量無顯著性差異,而dsLmCYP4G102-注射組若蟲的CHC含量明顯減少約83%。三、飛蝗ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白H家族基因分子特性與功能研究三磷酸腺苷結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類重要的跨膜蛋白超家族,參與生物體內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程�；陲w蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,根據(jù)黑腹果蠅D.melanogaster和赤擬谷盜T.castaneum ABCH亞家族核苷酸序列進(jìn)行同源序列搜索,獲得3條基因序列,分別將其命名為L(zhǎng)mABCH-9A,LmABCH-9B和LmABCH-9C;LmABCHs為半轉(zhuǎn)運(yùn)子蛋白,包含Walker A、Walker B和ABC特征基序C(LSGGQ)3個(gè)保守區(qū)域,在其C端均含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號(hào)KDEL。RT-qPCR表達(dá)分析結(jié)果顯示,LmABCH-9A在5齡期持續(xù)高表達(dá),LmABCH-9B和LmABCH-9C均在5齡第1天表達(dá)量最高,之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì);組織分布結(jié)果顯示,LmABCH-9A在所檢測(cè)的組織中均有表達(dá),其中在翅芽的表達(dá)量最高;LmABCH-9B和LmABCH-9C具有相似的組織表達(dá)模式,均在具有表皮結(jié)構(gòu)的組織(如體壁)和觸角中表達(dá)量較高。采用RNAi技術(shù),有效沉默LmABCHs表達(dá)后觀察發(fā)現(xiàn),ds LmABCH-9A-和dsLmABCH-9B-注射組若蟲均可正常生長(zhǎng)發(fā)育,順利蛻皮至下一齡期,無可見異常表型;而dsLmABCH-9C-注射組若蟲在蛻皮至下一齡期時(shí),部分若蟲在蛻皮過程中死亡,大部分若蟲在順利蛻皮后,體重會(huì)在短時(shí)間內(nèi)迅速減少,出現(xiàn)表皮皺縮現(xiàn)象,死亡率為100%,而高濕環(huán)境可以降低若蟲的死亡率。表皮滲透性檢測(cè)結(jié)果表明,沉默LmABCH-9C表達(dá)后,飛蝗表皮滲透性增強(qiáng),外界物質(zhì)可滲入表皮;透射電鏡觀察表皮結(jié)果發(fā)現(xiàn),抑制LmABCH-9C表達(dá)后,與對(duì)照組相比,原表皮中孔道內(nèi)物質(zhì)含量減少,推測(cè)LmABCH-9C參與表皮脂類物質(zhì)在孔道中的轉(zhuǎn)運(yùn);采用GC-MS檢測(cè)CHC含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,dsLmABCH-9C-注射組若蟲CHC含量減少約63.3%。綜上所述,本文研究發(fā)現(xiàn),通過RNAi技術(shù),高效抑制LmACC、LmCYP4G102和LmABCH-9C表達(dá)后,均會(huì)導(dǎo)致飛蝗蛻皮至下一齡期后的死亡表型。進(jìn)一步采用中性脂染色方法,超微結(jié)構(gòu)觀察技術(shù),以及氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)CHC含量的方法,研究發(fā)現(xiàn),飛蝗出現(xiàn)死亡表型的原因各有不同,LmACC作為脂肪酸合成的限速酶,主要參與飛蝗體內(nèi)脂類物質(zhì)的合成,為昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育提供能量,沉默該基因后,飛蝗體內(nèi)脂合成量減少,間接影響了CHC合成量;LmCYP4G102參與CHC的合成,該基因的沉默可導(dǎo)致表皮碳?xì)浠衔锖匡@著降低,保水性能減弱;LmABCH-9C負(fù)責(zé)將表皮脂類物質(zhì)通過孔道運(yùn)輸至上表皮層,抑制該基因表達(dá)后,脂類物質(zhì)無法到達(dá)上表皮層和外包膜,表皮碳?xì)浠衔锏暮繙p少,導(dǎo)致表皮保水性能減弱。本文篩選獲得了參與脂類合成的關(guān)鍵基因LmACC、參與表皮碳?xì)浠衔锖铣傻幕騆mCYP4G102和參與表皮脂轉(zhuǎn)運(yùn)的基因LmABCH-9C,豐富了昆蟲表皮脂的研究?jī)?nèi)容,為害蟲綠色防控提供了新的分子靶標(biāo)。
【圖文】：

圖 1-2 不同昆蟲表皮中脂類各組成成分所占百分比[17]main groups of compounds occurring in the epicuticular wax shownof total wax in different insect species.質(zhì)主要包括碳?xì)浠衔�、蠟、游離脂肪酸、醇、甘油三酯、甾

圖 1-3 果蠅幼蟲期絳色細(xì)胞的結(jié)構(gòu)[28]Fig 1-3 Larval oenocytes in Drosophila melanogaster.蟲側(cè)面觀，，體節(jié) A1-A6 均勻分布 1 個(gè)絳色細(xì)胞簇（綠色）；（B）部位是氣管。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q963

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本文編號(hào)：2624156