【摘要】：假眼小綠葉蟬Empoasca vitis(G(?)the)廣泛分布于我國(guó)各個(gè)茶區(qū),是最重要的茶葉害蟲之一。該蟲防治困難,主要依靠化學(xué)農(nóng)藥防治,導(dǎo)致了嚴(yán)重的“3R”問(wèn)題,因此迫切需要尋找其它防治方法。昆蟲海藻糖酶是滯育激素調(diào)節(jié)與幾丁質(zhì)合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶,對(duì)昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。本研究利用RACE技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù),不僅克隆得到了假眼小綠葉蟬海藻糖酶基因,明確了其表達(dá)情況,同時(shí)為防控葉蟬提供了新的思路,為最終發(fā)展持續(xù)控制害蟲的新技術(shù)奠定基礎(chǔ)。本論文的主要內(nèi)容及結(jié)果如下:(1).假眼小綠葉蟬內(nèi)參基因的篩選在假眼小綠葉蟬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選了5種內(nèi)參基因(18S,ACT,EF1α,RPL10,α-TuB)設(shè)計(jì)其特異性引物,運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同處理(不同發(fā)育階段、低溫脅迫處理、饑餓脅迫處理、不同農(nóng)藥濃度處理)下的假眼小綠葉蟬5個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性,并使用geNorm、NormFinder、Bestkeeper、ΔCt法以及RefFinder軟件對(duì)內(nèi)參基因的可靠性進(jìn)行分析。結(jié)果表明,在不同發(fā)育階段下,RPL10和EF1α的穩(wěn)定性最好;在農(nóng)藥脅迫下,18S和ACT是最好的內(nèi)參基因組合;在饑餓脅迫下,EF1α和RPL10是表達(dá)最穩(wěn)定的兩個(gè)基因;在低溫脅迫處理下,RPL10和EF1α是穩(wěn)定性最好的基因。(2).假眼小綠葉蟬海藻糖酶基因的克隆與分析通過(guò)RACE技術(shù)獲得海藻糖酶基因cDNA全長(zhǎng)為2469 bp,其中包含開放閱讀框ORF 1797 bp,一共編碼氨基酸642個(gè),起始密碼子和終止密碼子分別為ATG、TAG。序列中含有海藻糖酶基因的經(jīng)典標(biāo)簽序列“PGGRFREFYYWDSY”和“QWDYPNAWPP”以及一個(gè)甘氨酸富集區(qū)“GGGGEY”。預(yù)測(cè)編碼蛋白分子量為74185.44,理論等電點(diǎn)為5.80,不穩(wěn)定系數(shù)為38.91,分子式為C_(3361)H_(5091)N_(869)O_(972)S_(30),脂肪總數(shù)為77.59,總平均親水性-0.381。該氨基酸序列和已經(jīng)公布的其他昆蟲海藻糖酶基因有很高的相似性。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該基因預(yù)測(cè)存在兩個(gè)得分較高的跨膜區(qū),因此該海藻糖酶基因?yàn)槟そY(jié)合型海藻糖酶,并將其命名為EvTre2。(3).假眼小綠葉蟬海藻糖酶基因在不同處理下的表達(dá)分析海藻糖酶基因在不同處理下均有所表達(dá)。且在低溫脅迫處理下,各個(gè)低溫處理下的海藻糖酶基因表達(dá)較未處理成蟲相比均有所提高,在4℃處理一小時(shí)的樣品中表達(dá)量達(dá)到最高。在農(nóng)藥處理脅迫中,經(jīng)三個(gè)農(nóng)藥濃度處理的樣品的海藻糖酶基因表達(dá)量均有所提高,并且在濃度3000 mL/公頃時(shí)達(dá)到了最高。在不同發(fā)育階段下,若蟲的表達(dá)情況較成蟲有所下降。在饑餓脅迫處理下,各個(gè)時(shí)長(zhǎng)饑餓處理均有所提高,特別在饑餓60 h的樣品中表達(dá)量大幅提高。結(jié)果顯示EvTre2與假眼小綠葉蟬的抗逆性機(jī)制有著極為密切的關(guān)系。綜上所述,本研究首次成功地從假眼小綠葉蟬中克隆得到膜結(jié)合型海藻糖酶基因,并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析以及表達(dá)分析,為進(jìn)一步深入研究海藻糖基因在假眼小綠葉蟬中的的作用奠定基礎(chǔ),為防治假眼小綠葉蟬提供了新的思路。
【圖文】：

軟件對(duì) 5 對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行篩選，擴(kuò)增獲得 E. vitis 海藻糖酶基因?qū)π蛄羞M(jìn)行生物信息學(xué)分析。 對(duì)假眼小綠葉蟬在不同發(fā)育階段酶基因進(jìn)行表達(dá)分析，以驗(yàn)證假術(shù)路線如圖 1.1。杭州茶區(qū)假眼小綠葉蟬樣本的采集提取不同處理下的假眼

23 RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖 (M：DL2000 mark帶)l electrophoresis of Empoasca vitis’RNA(M：DL2 ：RNA)條內(nèi)參基因的克隆小綠葉蟬 cDNA 為模板,經(jīng) 5 對(duì)內(nèi)參基因引列，分別為 18S 為 180bp，，ACT 為 224bp，TuB 為 190 bp 的目的片段 (圖 3.2)，目的條后續(xù)試驗(yàn)。測(cè)序結(jié)果經(jīng) Blast 序列比對(duì)分析源性為 99%。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)計(jì)量大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.711

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本文編號(hào)：2622801