【摘要】：microRNAs(miRNAs)是一類21-24nt的內(nèi)源非編碼小分子RNA,參與調(diào)控植物的發(fā)育、衰老、死亡及對各種逆境脅迫響應(yīng)等。株型是一個重要的農(nóng)藝性狀,與作物的育種潛力,產(chǎn)量,收獲方式息息相關(guān)。雖然有很多基因被報道參與調(diào)作物控株型,但是油菜中miRNA參與株型調(diào)控的研究還不多。本研究通過高通量測序手段對頂端組織和早期發(fā)育的角果中的miRNA和靶基因進行挖掘,以期對株型調(diào)控的分子機理有一定了解,結(jié)果如下:1.矮桿緊湊型甘藍型油菜株型相關(guān)miRNA及靶基因的挖掘本課題組發(fā)現(xiàn)了一種棒狀株型油菜突變體,其具有重大的育種潛力。以回交后代中矮桿緊湊株型油菜突變體(rodlike)和正常株型油菜(normal)為實驗材料,對其莖頂端進行四個s RNA組學(xué)測序(兩次生物學(xué)重復(fù))和兩個降解組測序,挖掘參與調(diào)控株型的miRNAs。對高通量測序結(jié)果進行生物信息學(xué)分析,最終在四個小RNA文庫中共檢測到了925個miRNA前體;進一步分析發(fā)現(xiàn)315個miRNA前體對應(yīng)著74個已知的miRNA歸屬于38個miRNA家族,610個miRNA前體歸屬于327個新的miRNA。對MIRNA家族成員進行分析,發(fā)現(xiàn)miR169家族成員最多,其次是miR156家族,并發(fā)現(xiàn)一些miRNA家族成員在基因組上呈現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)或者隨機復(fù)制事件。差異miRNA分析結(jié)果得到5個已知miRNA和4個novel miRNA在棒狀突變體中顯著上調(diào)表達;另外,5個已知miRNA和3個novel miRNA在棒狀突變體中顯著下調(diào)表達,并通過實時定量驗證了miRNAs表達與測序結(jié)果一致。利用降解組測序鑒定到408個靶基因,其中25個已知miRNA家族的264個靶基因和58個novel miRNAs對應(yīng)的144個靶基因。通過5′RACE驗證了7個已知miRNA和1個novel miRNA的14個靶基因,證明降解組測序結(jié)果的可靠性。同時,挑選了4個差異miRNAs及其靶基因分析它們之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)它們呈負相關(guān)性,表明miRNA-target在頂端起作用。進一步分析表明,營養(yǎng)元素/金屬離子匱乏,能量供應(yīng)不足,衰老/早熟機制,還有miR319/miR164調(diào)控的TCP轉(zhuǎn)錄因子參與的分生組織活動可能導(dǎo)致頂端分生組織的提前終止。更重要的是轉(zhuǎn)基因結(jié)果表明TCP4基因能抑制頂端的生長,導(dǎo)致頂端終止發(fā)育。因此,我們推測miR319調(diào)控的TCP轉(zhuǎn)錄因子可能對雙子葉植物株型的調(diào)控起重要的作用。此外,本研究中預(yù)測到的novel miRNA的功能為油菜中miRNA的研究提供了大量有用數(shù)據(jù)。2.甘藍型油菜角果長度相關(guān)miRNA的挖掘本研究對回交后代中長角果(LS)和短角果(SS)材料開花0-7天的角果進行小RNA測序,構(gòu)建了4個小RNA文庫(兩次重復(fù))。測序結(jié)果總共鑒定到814個miRNA前體,其中255個前體代表36個miRNA家族的65個已知miRNA,559個前體代表394個novel miRNA。研究發(fā)現(xiàn)novel miRNA中有一些是已知miRNA的變異,如novel_mir_65和novel_mir_80與bna-miR164只有4個堿基差異,推測novel miRNA在進化上會越來越少,逐漸趨向于已知miRNAs。長短角果材料中的差異表達分析顯示17個miRNAs在LS和SS中存在顯著差異,進一步通過qRT-PCR驗證了9個miRNA定量結(jié)果與測序結(jié)果基本一致。構(gòu)建了LS和SS兩個降解組文庫,總共鑒定到522個剪切事件,包括33個已知miRNA介導(dǎo)的371個剪切事件和58個novel miRNA介導(dǎo)的151個剪切事件,且5′RLM-RACE驗證的結(jié)果與降解組測序結(jié)果相符。進一步分析了5個差異表達的miRNAs及其靶基因在兩個材料0,3,5,7 DAP角果中的動態(tài)表達模式,其中miR160和novel_mir_11在角果發(fā)育的各個時期都下調(diào)表達,表明這些miRNAs可能對角果發(fā)育起重要作用。進一步研究證實miR160在角果中有活性,并且在油菜中超量表達miR160抑制生長素響應(yīng)因子的表達,轉(zhuǎn)基因植株生長旺盛,角果長度增加,揭示了角果長的發(fā)育可能是通過生長素的響應(yīng)途徑調(diào)控�？偟膩碚f,我們推測miR159、miR319和novel_mir_11可能通過抑制細胞分裂,miR160通過調(diào)控生長素響應(yīng)來影響角果發(fā)育;而miR2111、miR399、miR827和miR408反映了角果發(fā)育過程中磷、銅元素的供應(yīng)不足,導(dǎo)致營養(yǎng)元素的缺乏對角果發(fā)育起到了限制作用。
【圖文】：

圖 1.1 蕓薹屬 6 個物種間的親緣關(guān)系（禹氏三角）綠色代表 A 染色體，紅色代表 B 染色體，藍色代表 C 染色體。.1 Genetic relationships between the six species of Brassica(triangosomes from A, B and C genome are represented by green, red and blue colours,想作物株型的意義想株型的研究進展物地上部分的綜合體現(xiàn)，主要受基因與環(huán)境的共同影響蘗/分枝角度、分蘗/分枝數(shù)目和長度、花器官形態(tài)以及角一個非常復(fù)雜的綜合性狀，對作物育種潛力起關(guān)鍵作用02)。作物株型反映了植株形態(tài)特征和空間排列方式，是區(qū)征之一。植物株型直接影響了植株間和植株內(nèi)對光，氣和種環(huán)境（病蟲害、風(fēng)）的抵抗能力。合理的株型可以增加

V/WUS(CLAVATA/WUSCHEL)途徑是莖頂端分生組織最重要的調(diào)控機制之一，構(gòu)成了負反饋調(diào)節(jié)機制，保證了分生組織的增殖與分化(Schoof et al 2000)。此外胞分裂素通路基因?qū)?WUS 也起重要的調(diào)控，WUS 也可直接抑制細胞分裂素負因子；同時，細胞分裂素還受生長素的負調(diào)控，生長素與細胞分裂素的平衡對莖頂端分生組織的增殖與分化起重要作用。另一個維持擬南芥頂端分生組織調(diào)控因是 STM，STM 編碼一種 homeodomain 蛋白，，是 knotted1(kn1)基因家族的一員有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能(Long et al 1996)。研究表明 STM 基因能夠抑制細胞分化，是頂生組織維持所必需的，異位表達 STM 可以誘導(dǎo)細胞分裂素合成基因 IPT7 引起分裂素增加，促進細胞分裂(Endrizzi et al 1996)。STM 的突變同樣能導(dǎo)致 SAM失，而外施細胞分裂素可以部分恢復(fù) stm 突變體的表型；STM 和 WUS 共同參M 的形成與維持，兩者具有互補性(Lenhard. et al 2002)。另外，有研究表明表傳修飾對將頂端分生組織的關(guān)鍵基因進行重編程，如水稻 WOX11 與 H3K27甲基化酶 JMJ705 結(jié)合，降低甲基化水平，促進莖頂端的正常生長(Cheng et al 20
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S565.4


本文編號：2622872