【摘要】：microRNAs(miRNAs)是一類21-24nt的內(nèi)源非編碼小分子RNA,參與調(diào)控植物的發(fā)育、衰老、死亡及對(duì)各種逆境脅迫響應(yīng)等。株型是一個(gè)重要的農(nóng)藝性狀,與作物的育種潛力,產(chǎn)量,收獲方式息息相關(guān)。雖然有很多基因被報(bào)道參與調(diào)作物控株型,但是油菜中miRNA參與株型調(diào)控的研究還不多。本研究通過(guò)高通量測(cè)序手段對(duì)頂端組織和早期發(fā)育的角果中的miRNA和靶基因進(jìn)行挖掘,以期對(duì)株型調(diào)控的分子機(jī)理有一定了解,結(jié)果如下:1.矮桿緊湊型甘藍(lán)型油菜株型相關(guān)miRNA及靶基因的挖掘本課題組發(fā)現(xiàn)了一種棒狀株型油菜突變體,其具有重大的育種潛力。以回交后代中矮桿緊湊株型油菜突變體(rodlike)和正常株型油菜(normal)為實(shí)驗(yàn)材料,對(duì)其莖頂端進(jìn)行四個(gè)s RNA組學(xué)測(cè)序(兩次生物學(xué)重復(fù))和兩個(gè)降解組測(cè)序,挖掘參與調(diào)控株型的miRNAs。對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析,最終在四個(gè)小RNA文庫(kù)中共檢測(cè)到了925個(gè)miRNA前體;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)315個(gè)miRNA前體對(duì)應(yīng)著74個(gè)已知的miRNA歸屬于38個(gè)miRNA家族,610個(gè)miRNA前體歸屬于327個(gè)新的miRNA。對(duì)MIRNA家族成員進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)miR169家族成員最多,其次是miR156家族,并發(fā)現(xiàn)一些miRNA家族成員在基因組上呈現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)或者隨機(jī)復(fù)制事件。差異miRNA分析結(jié)果得到5個(gè)已知miRNA和4個(gè)novel miRNA在棒狀突變體中顯著上調(diào)表達(dá);另外,5個(gè)已知miRNA和3個(gè)novel miRNA在棒狀突變體中顯著下調(diào)表達(dá),并通過(guò)實(shí)時(shí)定量驗(yàn)證了miRNAs表達(dá)與測(cè)序結(jié)果一致。利用降解組測(cè)序鑒定到408個(gè)靶基因,其中25個(gè)已知miRNA家族的264個(gè)靶基因和58個(gè)novel miRNAs對(duì)應(yīng)的144個(gè)靶基因。通過(guò)5′RACE驗(yàn)證了7個(gè)已知miRNA和1個(gè)novel miRNA的14個(gè)靶基因,證明降解組測(cè)序結(jié)果的可靠性。同時(shí),挑選了4個(gè)差異miRNAs及其靶基因分析它們之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)它們呈負(fù)相關(guān)性,表明miRNA-target在頂端起作用。進(jìn)一步分析表明,營(yíng)養(yǎng)元素/金屬離子匱乏,能量供應(yīng)不足,衰老/早熟機(jī)制,還有miR319/miR164調(diào)控的TCP轉(zhuǎn)錄因子參與的分生組織活動(dòng)可能導(dǎo)致頂端分生組織的提前終止。更重要的是轉(zhuǎn)基因結(jié)果表明TCP4基因能抑制頂端的生長(zhǎng),導(dǎo)致頂端終止發(fā)育。因此,我們推測(cè)miR319調(diào)控的TCP轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)雙子葉植物株型的調(diào)控起重要的作用。此外,本研究中預(yù)測(cè)到的novel miRNA的功能為油菜中miRNA的研究提供了大量有用數(shù)據(jù)。2.甘藍(lán)型油菜角果長(zhǎng)度相關(guān)miRNA的挖掘本研究對(duì)回交后代中長(zhǎng)角果(LS)和短角果(SS)材料開花0-7天的角果進(jìn)行小RNA測(cè)序,構(gòu)建了4個(gè)小RNA文庫(kù)(兩次重復(fù))。測(cè)序結(jié)果總共鑒定到814個(gè)miRNA前體,其中255個(gè)前體代表36個(gè)miRNA家族的65個(gè)已知miRNA,559個(gè)前體代表394個(gè)novel miRNA。研究發(fā)現(xiàn)novel miRNA中有一些是已知miRNA的變異,如novel_mir_65和novel_mir_80與bna-miR164只有4個(gè)堿基差異,推測(cè)novel miRNA在進(jìn)化上會(huì)越來(lái)越少,逐漸趨向于已知miRNAs。長(zhǎng)短角果材料中的差異表達(dá)分析顯示17個(gè)miRNAs在LS和SS中存在顯著差異,進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證了9個(gè)miRNA定量結(jié)果與測(cè)序結(jié)果基本一致。構(gòu)建了LS和SS兩個(gè)降解組文庫(kù),總共鑒定到522個(gè)剪切事件,包括33個(gè)已知miRNA介導(dǎo)的371個(gè)剪切事件和58個(gè)novel miRNA介導(dǎo)的151個(gè)剪切事件,且5′RLM-RACE驗(yàn)證的結(jié)果與降解組測(cè)序結(jié)果相符。進(jìn)一步分析了5個(gè)差異表達(dá)的miRNAs及其靶基因在兩個(gè)材料0,3,5,7 DAP角果中的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式,其中miR160和novel_mir_11在角果發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都下調(diào)表達(dá),表明這些miRNAs可能對(duì)角果發(fā)育起重要作用。進(jìn)一步研究證實(shí)miR160在角果中有活性,并且在油菜中超量表達(dá)miR160抑制生長(zhǎng)素響應(yīng)因子的表達(dá),轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)旺盛,角果長(zhǎng)度增加,揭示了角果長(zhǎng)的發(fā)育可能是通過(guò)生長(zhǎng)素的響應(yīng)途徑調(diào)控。總的來(lái)說(shuō),我們推測(cè)miR159、miR319和novel_mir_11可能通過(guò)抑制細(xì)胞分裂,miR160通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素響應(yīng)來(lái)影響角果發(fā)育;而miR2111、miR399、miR827和miR408反映了角果發(fā)育過(guò)程中磷、銅元素的供應(yīng)不足,導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)元素的缺乏對(duì)角果發(fā)育起到了限制作用。
【圖文】：

圖 1.1 蕓薹屬 6 個(gè)物種間的親緣關(guān)系（禹氏三角）綠色代表 A 染色體，紅色代表 B 染色體，藍(lán)色代表 C 染色體。.1 Genetic relationships between the six species of Brassica(triangosomes from A, B and C genome are represented by green, red and blue colours,想作物株型的意義想株型的研究進(jìn)展物地上部分的綜合體現(xiàn)，主要受基因與環(huán)境的共同影響蘗/分枝角度、分蘗/分枝數(shù)目和長(zhǎng)度、花器官形態(tài)以及角一個(gè)非常復(fù)雜的綜合性狀，對(duì)作物育種潛力起關(guān)鍵作用02)。作物株型反映了植株形態(tài)特征和空間排列方式，是區(qū)征之一。植物株型直接影響了植株間和植株內(nèi)對(duì)光，氣和種環(huán)境（病蟲害、風(fēng)）的抵抗能力。合理的株型可以增加

V/WUS(CLAVATA/WUSCHEL)途徑是莖頂端分生組織最重要的調(diào)控機(jī)制之一，構(gòu)成了負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，保證了分生組織的增殖與分化(Schoof et al 2000)。此外胞分裂素通路基因?qū)?WUS 也起重要的調(diào)控，WUS 也可直接抑制細(xì)胞分裂素負(fù)因子；同時(shí)，細(xì)胞分裂素還受生長(zhǎng)素的負(fù)調(diào)控，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的平衡對(duì)莖頂端分生組織的增殖與分化起重要作用。另一個(gè)維持?jǐn)M南芥頂端分生組織調(diào)控因是 STM，STM 編碼一種 homeodomain 蛋白，，是 knotted1(kn1)基因家族的一員有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能(Long et al 1996)。研究表明 STM 基因能夠抑制細(xì)胞分化，是頂生組織維持所必需的，異位表達(dá) STM 可以誘導(dǎo)細(xì)胞分裂素合成基因 IPT7 引起分裂素增加，促進(jìn)細(xì)胞分裂(Endrizzi et al 1996)。STM 的突變同樣能導(dǎo)致 SAM失，而外施細(xì)胞分裂素可以部分恢復(fù) stm 突變體的表型；STM 和 WUS 共同參M 的形成與維持，兩者具有互補(bǔ)性(Lenhard. et al 2002)。另外，有研究表明表傳修飾對(duì)將頂端分生組織的關(guān)鍵基因進(jìn)行重編程，如水稻 WOX11 與 H3K27甲基化酶 JMJ705 結(jié)合，降低甲基化水平，促進(jìn)莖頂端的正常生長(zhǎng)(Cheng et al 20
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S565.4


本文編號(hào)：2622872