【摘要】：葉酸具有重要的生理功能,隨著葉酸生物合成途徑的逐漸明朗,為了提高天然葉酸產(chǎn)量進(jìn)而滿足人類需求,研究葉酸生物合成關(guān)鍵基因或通過(guò)基因工程改變植物和微生物中葉酸的代謝受到相當(dāng)重視。目前大量研究?jī)H局限于通過(guò)過(guò)表達(dá)葉酸生物合成關(guān)鍵基因的方式來(lái)提高葉酸產(chǎn)量,而利用基因敲除技術(shù)針對(duì)基因本身的功能研究屈指可數(shù)。本研究通過(guò)同源重組的基因敲除技術(shù)對(duì)植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)YM-4-3菌株的folE、folKE、folP基因進(jìn)行敲除,從而研究它們對(duì)L.plantarum葉酸生物合成及生長(zhǎng)的作用。對(duì)L.plantarum YM-4-3菌株中葉酸生物合成途徑關(guān)鍵基因folE、folK、folP、folB及folQ進(jìn)行序列比對(duì)及拼接后發(fā)現(xiàn),這些基因在基因組中以基因簇形式存在;由此利用溫度敏感型質(zhì)粒pFED760通過(guò)同源重組構(gòu)建了folE、folKE、folP基因的敲除株ΔfolE、ΔfolKE、ΔfolP,并通過(guò)PCR和DNA分子雜交(southern blot)技術(shù)進(jìn)一步得到驗(yàn)證,同時(shí)證明這三個(gè)基因均為單拷貝基因。后期實(shí)驗(yàn)以ΔfolE、ΔfolKE、ΔfolP菌株作為研究對(duì)象,通過(guò)觀察液體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)ΔfolP菌株進(jìn)行沉淀生長(zhǎng),而ΔfolE和ΔfolKE菌株能均勻生長(zhǎng);掃描電鏡和透射電鏡分析結(jié)果顯示,與野生型YM-4-3菌株相比,ΔfolE菌株的細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生改變,而ΔfolKE與ΔfolP菌株的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生較大變化,細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附性增強(qiáng),有些細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則桿狀,發(fā)生質(zhì)壁分離,甚至出現(xiàn)凹陷,細(xì)胞壁破裂,內(nèi)容物外泄等現(xiàn)象;通過(guò)對(duì)敲除株和野生株生長(zhǎng)狀態(tài)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn),敲除株的生長(zhǎng)速率和生物量明顯低于野生株,生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)且產(chǎn)酸能力減弱;葉酸產(chǎn)量的測(cè)定結(jié)果表明,各個(gè)菌株發(fā)酵液中葉酸含量隨時(shí)間呈波動(dòng)式增減,敲除株發(fā)酵液的葉酸總含量與野生株發(fā)酵液葉酸總含量差異較大。綜上,證明folE、folKE、folP基因在葉酸生物合成及菌株生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用,其中folP基因與菌株生長(zhǎng)相關(guān),而folKE與folP基因與細(xì)胞形態(tài)相關(guān),且進(jìn)一步證明folE與folK基因單獨(dú)編碼蛋白。利用表達(dá)載體pMG36e成功構(gòu)建了folP基因的回補(bǔ)菌株H-folP與過(guò)表達(dá)菌株B-folP;熒光定量PCR分析結(jié)果顯示,folP基因在H-folP菌株和B-folP菌株的表達(dá)量分別約為野生型YM-4-3菌株的177.87倍和40.28倍;但是H-folP菌株和B-folP菌株發(fā)酵液中葉酸含量相比野生型菌株低,故推測(cè)folP基因存在反饋抑制。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究了葉酸生物合成途徑中的關(guān)鍵基因folE、folKE、folP的生物學(xué)功能,為研究植物乳桿菌葉酸生物合成途徑的分子調(diào)控機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ),為探索植物乳桿菌其他葉酸生物合成途徑提供了新思路。
【圖文】：

第一章 緒論 葉酸簡(jiǎn)介.1 葉酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)葉酸，，因從菠菜葉中提取純化而得名。其化學(xué)名為蝶酰谷氨酸(pteroylglutamic ac種由蝶呤、對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid, pABA)和一個(gè)或多個(gè)谷氨酸結(jié)合而成性 B 族維生素，即維生素 B9。作為食品強(qiáng)化劑的合成葉酸(folic acid)常與天然葉ate)混淆，前者只含有一個(gè)谷氨酸尾巴而后者則是由多個(gè)谷氨酸尾巴組成(圖 1.1)[1]。

圖 1.2 參與一碳代謝的不同形式葉酸結(jié)構(gòu)[3]Fig. 1.2 Structures of one-carbon metabolism folates[3]是一種無(wú)色無(wú)味的黃色或橙黃色的晶體或晶狀粉末，加熱至 250℃即行溶性維生素，但在 25℃的水中其溶解度僅為 0.0016 mg/mL，在沸水中、氫氧化鉀等堿性溶液，不溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。葉酸在堿性或穩(wěn)定，在酸性條件下極不穩(wěn)定，在光照條件下，尤其是紫外線的照射下易要密封、避光儲(chǔ)存[4]。酸的生理功能是參與幾乎所有生物代謝的必須微量元素，因?yàn)樵谖镔|(zhì)的合成和代謝中人無(wú)法離開葉酸而生存。一旦被機(jī)體吸收后，除了儲(chǔ)存于肝臟的一部分 5 種具有活性的輔酶形式作為一碳單元的傳送裝置，從而參與 DNA 和 ]，氨基酸的代謝及血紅蛋白的合成等生理代謝過(guò)程[6]。此外，葉酸中的量游離碳離子，它是形成神經(jīng)末梢和構(gòu)成傳遞神經(jīng)沖動(dòng)的重要化學(xué)原料
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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2 楊玉柱;王儲(chǔ)炎;焦必寧;;葉酸的研究進(jìn)展[J];農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊);2006年05期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 王維;葉酸的綠色合成工藝研究[D];東南大學(xué);2016年

2 費(fèi)永濤;一株植物乳桿菌的分子鑒定及其亞硝酸鹽降解相關(guān)基因敲除[D];華南理工大學(xué);2015年

3 劉天周;folP1與folP2基因在磺胺甲惡唑—甲氧芐啶抗分枝桿菌中的作用機(jī)制研究[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2015年

4 徐玲燕;產(chǎn)葉酸菌株的篩選、生物學(xué)特性研究和發(fā)酵條件優(yōu)化[D];浙江工業(yè)大學(xué);2012年

5 趙宏飛;產(chǎn)葉酸乳酸菌的篩選及生物學(xué)特性研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2621755