發(fā)布時間：2020-04-09 22:48

【摘要】：目的:檢定在人肝細胞癌細胞中,抑制KCTD10蛋白的表達能否影響肝癌細胞的干細胞樣特性及其分子機制。方法:使用包裝KCTD1O siRNA序列的慢病毒感染人肝癌細胞系Hep3B細胞和MHCC97H細胞,qPCR和蛋白質(zhì)印跡(WB)的方法確認抑制效果。腫瘤球形成實驗、平皿集落形成實驗、細胞增殖實驗和劃痕實驗分析抑制KCTD10表達對肝癌細胞體外致瘤性、自我更新能力和細胞體外遷移能力的影響。分別用qPCR、WB實驗和熒光抗體標記流式細胞實驗檢測干細胞標記基因以及Notch信號通路的影響。結(jié)果:轉(zhuǎn)染包裝了 KCTD10 siRNA序列的慢病毒可以有效抑制Hep3B和MHCC97H細胞中KCTD10mRNA和蛋白含量;抑制KCTD1O的表達可以增加腫瘤球形成率、平皿集落形成能力,增強細胞增殖速率、細胞體外遷移能力,并增強肝癌干細胞標記基因CD133、OCT4以及Bmi1基因的mRNA水平,以及肝癌干細胞標記基因多能轉(zhuǎn)錄因子Nanog、乙醛脫氫酶1家族成員A1(ALDH1A1)蛋白水平;增加肝癌細胞中CD133+細胞比例。同時,抑制KCTD10蛋白的表達可以影響Notch信號通路的表達調(diào)控。結(jié)論:1.抑制Kctd10基因表達可以增強肝癌細胞致瘤性。2.抑制Kctd10基因表達可以增強肝癌干細胞特性。3.在肝癌細胞中抑制Kctd10基因表達能影響Notch信號通路的表達調(diào)控。
【圖文】：

過ＲＴ－ＰＣＲ方法檢測尤以川基因ｍＲＮＡ的含量，３６Ｂ４作為內(nèi)參。首先，復肝癌細胞系細胞，而后取各肝癌細胞系對數(shù)生長期細胞，提取各型細胞的ＲＮＡ；通過Ｓｙｎｅｒｇｙ多功能酶標儀檢測ｍＲＮＡ的含量以及質(zhì)量，結(jié)果顯示，逡逑６０／２８０的范圍基本控制在１．８－２．０之間（表６）。為了進一步檢測提取的ｍＲＮ質(zhì)量，我們將提取的ＲＮＡ進行瓊脂糖凝膠電泳，，結(jié)果顯示，總ｍＲＮＡ在１８Ｓ及２８Ｓ的亮度較高，說明提取的ｍＲＮＡ的質(zhì)量較高（圖卜１）。逡逑表６各型細胞的ｍＲＮＡ的２６０／２８０的比值以及含量逡逑ｖ°邐ｖ邐＾邐＾邐＾邐々逡逑６０（ｎｍ）邐１．２１８邐１．４２３邐２．１７８邐０．９６１邐０．７５邐１．２２３邐２．２２４逡逑８０（ｎｍ）邐０．６４２邐０．７４２邐１．１３２邐０．６２６邐０．３９６邐０．６４８邐１．２１逡逑６０／２８０邐１．８９９邐１．９１７邐１．９２４邐１．５３４邐１．８９３邐１．８８８邐１．８３７逡逑度（ｎｇ＿Ｌ）邋９７４．６０３邐１１３８．５９９邐１７４２．７８５邐７６８．６７９邋６００．１９５邐９７８．７９１邋１７７９．２５４逡逑

３．２．１人肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞系細胞體外培養(yǎng)逡逑使用細胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞，Ｈｅｐ３Ｂ細胞在細胞培養(yǎng)逡逑瓶中呈單層貼壁生長（圖２－１），細胞呈多邊形，折光性好，培養(yǎng)２天，細胞貼壁逡逑率可達９０％。逡逑W逡逑圖２－１邋Ｈｅｐ３Ｂ細胞系單層貼壁生長細胞倒置相差顯微鏡圖像（１００Ｘ）逡逑１４逡逑
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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1 王菊;符毓豪;王維山;王端明;周宗瑤;;Oct-4在小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞定向誘導分化中的甲基化狀態(tài)[J];中國醫(yī)學科學院學報;2013年03期

2 孫吉康;張波;張健;周建林;;小鼠KCTD10特異性抗體制備及其在小鼠背神經(jīng)上皮和背根神經(jīng)節(jié)中的表達[J];生物工程學報;2007年06期

本文編號：2621359