【摘要】：大豆(Glycine max(L.)Merr.)是典型的短日植物,在光周期現(xiàn)象研究中被作為重要模式材料。近十年來,大豆開花期相關的關鍵基因先后被定位和克隆,開花調(diào)控分子機制研究逐步深入。在已發(fā)現(xiàn)的調(diào)控大豆開花期的E系列基因中,豆科植物所特有的E1基因?qū)﹂_花期影響最大,并且發(fā)現(xiàn)在大豆中存在兩個E1同源基因E1La和E1Lb,這兩個E1同源基因?qū)Υ蠖沟纳M程也有抑制作用。本研究應用根癌農(nóng)桿菌介導大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系,采用RNAi技術和CRISPR/Cas9系統(tǒng)對E1基因進行功能分析,以期從多角度驗證其在大豆生育進程中所起的作用。主要研究成果如下:1.參照Williams 82基因組信息設計合適的引物,克隆晚熟品種自貢冬豆和中熟品種Jack的E1和E1La/b,將所得序列在NCBI上進行比對,得知3個基因在自貢冬豆中的基因型分別為E1、E1La和E1Lb,在Jack中的基因型分別為e1-as、E1La和E1Lb。該實驗結(jié)果為后續(xù)實驗中引物的設計和轉(zhuǎn)化受體的選擇提供了理論依據(jù)。2.利用GATEWAY技術和植物Cas9/gRNA質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒構(gòu)建了RNA干擾載體pB7GWIWG2(II)-E1和基因編輯載體CRISPR/Cas9-E1,兩個載體均帶有篩選基因bar。借助農(nóng)桿菌介導的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化技術,將兩個載體分別轉(zhuǎn)入受體基因型自貢冬豆中,通過除草劑涂抹、PCR和試紙條檢測三種方法分別鑒定出38和46株陽性轉(zhuǎn)化植株。3.E1-RNAi T1植株在北京夏播自然條件下可提前開花,比野生型在短日條件下開花更早。鑒于E1基因干擾植株的早熟表型,在8月中旬北京自然條件下對其進行加代擴繁,T2轉(zhuǎn)基因植株的開花期和成熟期均顯著早于野生型植株。在E1基因干擾后代植株中,E1、E1La和E1Lb基因的表達量均顯著降低,受E1基因上調(diào)表達的開花抑制因子GmFT4基因表達量也呈現(xiàn)下降趨勢,而開花促進因子GmFT2a/5a基因的表達量升高。4.經(jīng)測序檢測,4株E1-CRISPR/Cas9 T0植株在E1靶位點處發(fā)生了編輯,有1株在T1代發(fā)生編輯并產(chǎn)生了1株純合突變體植株和6株雜合突變體植株。E1基因純合突變體植株在北京夏播后期短日處理的條件下開花時間稍早于野生型,E1基因雜合突變體與野生型無明顯差異。
【圖文】：

科學院碩士學位論文 結(jié)果表明，經(jīng)過誘導開花處理后的大豆植株在一定的條件下可以恢復到營養(yǎng)稱之為大豆開花逆轉(zhuǎn)（韓天富等，1998）。開花逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象的研究以典型的光豆為材料，初步建立并完善了用于實驗室研究的大豆光周期反應研究系統(tǒng)。豆植株在一定的光周期條件下會發(fā)生開花逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，使頂端分生組織由生殖生長階段，改變光周期條件又可以使之重回生殖生長階段，正常地開花和結(jié)豆光周期反應研究系統(tǒng)對大豆的開花逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象進行了進一步的深入研究和分0）（如圖 1-1），該系統(tǒng)中包括持續(xù)短日照處理(SD, 12 h/12 h)、短日照處理 13理(SD13 d-LD)和持續(xù)長日照處理(LD, 16 h/8 h)三種處理方式。供試材料自貢后轉(zhuǎn)移至長日照處理，4 個星期即可由生殖生長階段恢復到營養(yǎng)生長階段，現(xiàn)象叫做整株逆轉(zhuǎn)(Whole-Plant Reversion)。在某些處理條件下，僅有部分花生長階段，其余的仍保持原生長狀態(tài)，，這樣的開花逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象稱為局部n)，局部逆轉(zhuǎn)又包括花逆轉(zhuǎn)(Floral Reversion)和花序逆轉(zhuǎn)(Inflorescence Rever逆轉(zhuǎn)又被進一步細分成頂端花序逆轉(zhuǎn)(Terminal Inflorescence Reversion)和側(cè)Inflorescence Reversion) (吳存祥, 2000; Wu et al., 2006; Jiang et al., 2011)。

圖 1-2 大豆開花調(diào)控網(wǎng)絡示意圖（Xia et al., 2012）Fig.1-2 The flowering-time gene network in soybean (Xia et al., 20在大豆育種中的應用研究現(xiàn)狀油脂、蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)的重要作物，對農(nóng)業(yè)、技的進步和人民生活水平的提高，使得人們對大豆產(chǎn)在著年限長、選擇性差等局限性，轉(zhuǎn)基因技術的出現(xiàn)的的影響。轉(zhuǎn)基因技術自從 1984 年首次在大豆中應用隨著生物技術的發(fā)展和創(chuàng)新，已經(jīng)應用到大豆育種的gata et al., 2017)、抗除草劑及高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)(Duke et al., 20作制度得以更新，擴大了大豆的種植規(guī)模，降低了農(nóng)民強了在大豆產(chǎn)業(yè)界的影響力。轉(zhuǎn)基因技術在中國大豆經(jīng)過科研工作者的努力，已經(jīng)在提高大豆的油分和蛋
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S565.1

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本文編號：2620962