發(fā)布時(shí)間：2020-04-09 05:23

【摘要】：菰黑粉菌(Ustilago esculenta)是一種可以侵染茭白植株(Zizania latifolia)的內(nèi)生活體營養(yǎng)真菌。其侵染茭白植株后能夠抑制植株抽穗開花并引起植株莖部膨大形成可食用的茭白。在環(huán)境因素的影響下,菰黑粉菌形態(tài)可以完成從單核酵母型到雙核菌絲型的轉(zhuǎn)化,是一種典型的二型態(tài)病原真菌。菰黑粉菌的侵染能力及致病性與其二型態(tài)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn),菰黑粉菌二型態(tài)的轉(zhuǎn)化受MAPK信號途徑和PKA信號途徑共同調(diào)節(jié)。PKA全酶由兩個(gè)催化亞基(PkaC)和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基(PkaR)組成,不具有激酶活性。當(dāng)?shù)诙攀筩AMP與無活性的PKA調(diào)節(jié)亞基相結(jié)合后,能夠誘導(dǎo)其構(gòu)象發(fā)生變化,導(dǎo)致具有激酶活性的催化亞基被釋放。本研究圍繞PKA信號途徑對菰黑粉菌生長,侵染及二形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響展開。本研究發(fā)現(xiàn),外源添加cAMP后菌絲失去極性生長能力,單倍體菌株出芽后無法及時(shí)分裂,出現(xiàn)多位點(diǎn)芽殖的現(xiàn)象,且高濃度的cAMP影響性親和菌株融合菌絲的生長。本研究推測PKA信號途徑可能影響菰黑粉菌的極性生長。為進(jìn)一步驗(yàn)證本研究的猜測,本研究對菰黑粉菌PKA信號途徑催化亞基UePkaC基因進(jìn)行深入研究。本研究克隆得到的菰黑粉菌PKA催化亞基UePkaC與玉米黑粉菌、玉米絲黑穗菌等的PKA催化亞基具有較高的同源性。通過同源重組將UePkaC敲除后發(fā)現(xiàn),UePkaC不影響菰黑粉菌的生長速率,但UePkaC缺失導(dǎo)致菰黑粉菌菌體變長。UePkaC基因在融合初期便受到顯著上調(diào),且任意一方的UePkaC缺失都會導(dǎo)致兩個(gè)性親和單倍體無法融合,侵染實(shí)驗(yàn)也表明UePkaC缺失導(dǎo)致兩個(gè)性親和單倍體在植物表面無法正常形成雙核菌絲侵染植物。UePkaC參與融合過程可能是因?yàn)槠淇梢哉{(diào)控控制接合管生長的信息素基因表達(dá)。以上結(jié)果表明PKA信號途徑可能參與調(diào)控菰黑粉菌單倍體的融合以及極性生長過程。Actin單體聚合形成微絲(F-actin),與真菌極性生長有密切關(guān)系。Actin的聚合(polymerization)以及解聚(depolymerization)受磷酸化調(diào)控。已有體外實(shí)驗(yàn)證明PKA可以直接磷酸化Actin,但體內(nèi)尚缺乏實(shí)驗(yàn)支持。本研究克隆得到了菰黑粉菌UeActin基因,預(yù)測得到了UeActin基因上UePkaC基因的2個(gè)特異性磷酸化位點(diǎn)。本研究構(gòu)建了UeT14::UeActin一個(gè)過表達(dá)菌株,UeT14::UeActin~(T204I),UeT14::UeActin~(T205I),UeT14::UeActin~(T204IT205I)3個(gè)過表達(dá)點(diǎn)突變菌株。通過與過表達(dá)菌株的對比,發(fā)現(xiàn)磷酸化位點(diǎn)被改變后菰黑粉菌的表型沒有明顯變化。通過免疫熒光實(shí)驗(yàn),明確UeActin基因的亞細(xì)胞定位。對比UeT14::UeActin與UeT14△UePkaC::UeActin菌株中,但UeActin基因均呈現(xiàn)點(diǎn)狀均勻分布于細(xì)胞內(nèi),本研究推測UePkaC基因可能不是通過磷酸化來調(diào)控UeActin基因從而影響菰黑粉菌的極性生長。UePkaC基因如何調(diào)控菰黑粉菌的極性生長,仍需要大量的實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證。
【圖文】：

3.1 第二信使 cAMP 影響菰黑粉菌的極性生長3.1.1 外源添加第二信使在 YEPS 液體培養(yǎng)基內(nèi)加入本研究得到活力較好的菰黑粉菌添加 30 μMcAMP 的液體微鏡下觀察并取樣。本研究芽的方式進(jìn)行芽殖生長。生型菰黑粉菌不再以頂端出芽的方式生長黑粉菌出芽的位點(diǎn)發(fā)生了改變的出芽方式按時(shí)間順序進(jìn)行了一個(gè)統(tǒng)計(jì)比。結(jié)果顯示，在外源添加著時(shí)間的推移多位點(diǎn)芽殖比例逐漸降低到 2%以下。而野生型菌株存在一定的的多位點(diǎn)芽殖現(xiàn)象cAMP 對菰黑粉菌單倍體極性生長的影響基內(nèi)加入 30 μM 的 cAMP。將在經(jīng)過活化、小搖菰黑粉菌。將菌液以 1:100 的體積比分別接入液體 YEPS 培養(yǎng)基中，12 h，24 h，36 h，48 h本研究發(fā)現(xiàn)野生型菰黑粉菌在 YEPS 液體培養(yǎng)基中以頂端出。而在外源添加 30 μMcAMP 的 YEPS 液體培養(yǎng)基中生型菰黑粉菌不再以頂端出芽的方式生長。在顯微鏡下，本研究觀察到視野內(nèi)菰黑粉菌出芽的位點(diǎn)發(fā)生了改變，出現(xiàn)多位點(diǎn)芽殖的現(xiàn)象(圖 1A)。的出芽方式按時(shí)間順序進(jìn)行了一個(gè)統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算了多位點(diǎn)芽殖在觀察樣品中的占在外源添加 cAMP 的樣品中，多位點(diǎn)芽殖比例在(圖 1B)。在 48 h 后，多位而野生型菌株，在晚期由于自生的衰老，芽殖位點(diǎn)出現(xiàn)錯(cuò)亂存在一定的的多位點(diǎn)芽殖現(xiàn)象。單倍體極性生長的影響小搖、擴(kuò)搖后，接入普通及外源，60 h，在顯液體培養(yǎng)基中，野觀察到視野內(nèi)菰。本研究對這樣并計(jì)算了多位點(diǎn)芽殖在觀察樣品中的占在 12 h 最高，隨多位點(diǎn)芽殖比例降芽殖位點(diǎn)出現(xiàn)錯(cuò)亂，也會

添加第二信使步探求第二信使的菌液混合，，點(diǎn)樣在基上，12 h，，UeT14，UeT55顯微鏡下觀察到菌絲生成。而在YEPS中加入能在光學(xué)顯微鏡下觀察到接合管而無菌絲的生成（圖 3.2），本研究向外擴(kuò)展，菌絲長度大約在體培養(yǎng)基中，二信使 cAMP中國計(jì)量大學(xué)碩士學(xué)位論文cAMP 對菰黑粉菌融合的影響cAMP 對菰黑粉菌融合的作用，本研究點(diǎn)樣在YEPS固體培養(yǎng)基和YEPS中加入3024 h，36 h，48 h ，60 h，72 h 進(jìn)行觀察菌株能夠在 24 h 在細(xì)胞顯微鏡下觀察顯微鏡下觀察到菌絲生成；在 48 h，在體式顯微鏡下可以30 μM的cAMP的固體培養(yǎng)基上，本能在光學(xué)顯微鏡下觀察到接合管而無菌絲的生成。觀測后本研究可以觀察到在 YEPS 培養(yǎng)基上，菌落的菌絲長度大約在 1500 μm。而在 YEPS 外源添，菌絲失去向外生長的能力被抑制，菌絲均勻能夠抑制融合菌絲的極性生長。本研究進(jìn)行觀察在細(xì)胞顯微鏡下觀察在體式顯微鏡下可以本觀測后菌落菌絲均勻
【學(xué)位授予單位】：中國計(jì)量大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S645.2;S182

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本文編號：2620350