【摘要】：目的:心境障礙是一類危害性極大的復(fù)雜性疾病,探討心境障礙發(fā)病機(jī)制意義重大,然而有關(guān)該復(fù)雜性疾病的發(fā)病機(jī)理還遠(yuǎn)未定論。遺傳學(xué)研究顯示其遺傳度高達(dá)80%-85%,課題組基于目前心境障礙遺傳學(xué)研究現(xiàn)狀,假設(shè)心境障礙為一譜系疾病,可能存在共同的遺傳基礎(chǔ),在同一家系中可能存在共同的致病突變。全外顯子捕獲測(cè)序(WES)選擇基因組的編碼序列進(jìn)行測(cè)序,相對(duì)于全基因組測(cè)序(WGS)具有高效、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確度高優(yōu)點(diǎn),適用于多因子復(fù)雜疾病的家系研究。本課題組選擇心境障礙家系樣本,采用全基因組外顯子測(cè)序技術(shù),篩選心境障礙候選易感基因/位點(diǎn),進(jìn)行細(xì)胞、動(dòng)物水平及人群水平功能學(xué)驗(yàn)證,從遺傳學(xué)角度探討心境障礙發(fā)病機(jī)制。方法:1、心境障礙易感基因篩選選取一組4代心境障礙家系樣本共32人,對(duì)該家系22例(9例心境障礙患者、13例對(duì)照)成員樣本進(jìn)行了全基因外顯子捕獲測(cè)序,篩選出心境障礙家系易感基因,并從生物信息學(xué)角度探討其可能的生物學(xué)功能。2、人群驗(yàn)證(1)人群頻率驗(yàn)證選取心境障礙患者307例,檢測(cè)該家系中易感基因突變位點(diǎn)在散發(fā)心境障礙患者中的頻率;(2)表達(dá)水平驗(yàn)證1)心境障礙家系:RT-qPCR檢測(cè)原家系中攜帶/不攜帶有易感基因致病突變位點(diǎn)的成員m RNA表達(dá)水平,比較表達(dá)水平的差異;2)心境障礙散發(fā)患者:對(duì)22例散發(fā)未用藥抑郁障礙患者進(jìn)行表達(dá)水平驗(yàn)證,同期收集22名正常健康對(duì)照。病例組規(guī)范化抗抑郁藥物治療8周。進(jìn)行外周血MAPKAP1表達(dá)異常在病例對(duì)照之間及治療前后的比較分析。3、細(xì)胞水平驗(yàn)證選取人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)細(xì)胞系,對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行N.C.siRNA和MAPKAP1-siRNA病毒轉(zhuǎn)染,Real-Time qPCR、western-blot檢測(cè)易感基因和其作用靶點(diǎn)及其信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)基因表達(dá)量,比較其表達(dá)水平有無(wú)差異,探討易感基因在神經(jīng)細(xì)胞中可能的生物學(xué)功能。4、MAPKAP1信號(hào)通路與心境障礙分析(1)動(dòng)物水平GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中提取編號(hào)為GDS5307的數(shù)據(jù),對(duì)19例小鼠大腦(11例抑郁小鼠,其中7例抗抑郁治療有效,4例抗抑郁治療阻抗,8例正常對(duì)照小鼠)前額葉背側(cè)、腹側(cè)腦組織中檢測(cè)MAPKAP1及其相關(guān)通路基因的RNA表達(dá)水平。(2)人群水平1)人群外周血樣本GPL10558數(shù)據(jù)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中提取編號(hào)為GPL10558數(shù)據(jù),29例病例(21例MDD,8例BD)和24例性別、年齡均匹配的健康對(duì)照,對(duì)53例病例對(duì)照樣本的外周血MAPKAP1、AKT1、GSK3B和β-catenin的RNA表達(dá)水平進(jìn)行差異分析。2)人群腦組織樣本GSE53987數(shù)據(jù)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中提取編號(hào)為GSE53987及GSE53987數(shù)據(jù),34例病例(17例MDD,17例BD)和19例性別、年齡均匹配的健康對(duì)照,對(duì)53例病例對(duì)照樣本中大腦前額葉組織及海馬組織MAPKAP1、AKT1、GSK3B和β-catenin的RNA表達(dá)水平進(jìn)行差異分析。結(jié)果:1、心境障礙易感基因篩選根據(jù)Medel Scan軟件的分析結(jié)果,對(duì)初篩的26個(gè)心境障礙易感候選基因按增加疾病易感性的可能性大小排序,排在首位的是MAPKAP1基因,該基因是mTORC2的獨(dú)特成分,mTORC2能磷酸化Akt的S473位點(diǎn)激活A(yù)kt,而激活的Akt通過(guò)雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路(PI3K/Akt/mTORC2)發(fā)揮神經(jīng)可塑性生物學(xué)功能,在大腦中影響著神經(jīng)干細(xì)胞的分裂、神經(jīng)環(huán)路的形成、神經(jīng)可塑性等功能,其變異與許多神經(jīng)精神疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。因此,MAPKAP1可能通過(guò)mTORC2通路介導(dǎo)神經(jīng)可塑性參與了心境障礙的發(fā)生、發(fā)展。2、人群驗(yàn)證(1)人群頻率驗(yàn)證利用在線千人計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)信息獲得正常成人的位點(diǎn)突變資料與抑郁障礙患者進(jìn)行比較。307例病例組的rs78809014等位基因G突變頻率為6.1%,高于CHB正常人群4.4%;明顯高于CHB+CHS3.1%(χ2=4.57,P=0.03);明顯高于ESA2.8%(χ2=10.50,P=0.001)。數(shù)量性狀分析顯示MAPKAP1基因多態(tài)性與認(rèn)知障礙因子及認(rèn)知障礙因子中有罪感和自殺有關(guān)聯(lián)(P0.05),攜帶有G等位基因的患者認(rèn)知障礙因子、有罪感及自殺分值明顯高于攜帶有C等位基因者。(2)表達(dá)水平驗(yàn)證1)MAPKAP1的RNA表達(dá)水平在病例組明顯高于對(duì)照組(t=-3.654,P=0.001),經(jīng)過(guò)8周抗抑郁藥物治療,MAPKAP1表達(dá)水平明顯減低(t=-2.105,P=0.048),但仍高于對(duì)照組(t=-2.131,P=0.039);2)MAPKAP1與HAMD-17總分無(wú)相關(guān)性,與阻滯因子存在正相關(guān)關(guān)系(r=-0.444,P=0.038),與組成阻滯因子的抑郁情緒評(píng)分存在正相關(guān)關(guān)系(r=-0.470,P=0.027);3)MAPKAP1與即刻記憶存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.531,P0.001),與視覺(jué)廣度存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.456,P=0.002),與連線1時(shí)間存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.425,P=0.004)。3、細(xì)胞驗(yàn)證:(1)MAPKAP表達(dá)水平在MAPKAP1-siRNA組細(xì)胞比N.C.siRNA組細(xì)胞明顯降低。且GSK3B、β-catenin也較N.C.siRNA組降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明MAPKAP1表達(dá)降低可引起通路相關(guān)基因表達(dá)在SH-SY5Y中發(fā)生變化;(2)AKT1及磷酸化AKT1蛋白表達(dá)在細(xì)胞正常組細(xì)胞、N.C.siRNA組細(xì)胞和MAPKAP1-siRNA三組細(xì)胞間比較,結(jié)果顯示,磷酸化AKT1蛋白表達(dá)在MAPKAP1-siRNA細(xì)胞灰度明顯降低。4、MAPKAP1信號(hào)通路與心境障礙(1)動(dòng)物水平抑郁小鼠與正常對(duì)照MAPKAP1及通路相關(guān)基因在小鼠大腦前額葉腹側(cè)腦RNA表達(dá)水平差異比較:MAPKAP1表達(dá)在抑郁小鼠中表達(dá)組明顯高于正常對(duì)照組(t=-3.216,P=0.005),MAPKAP1表達(dá)抗抑郁治療有效組高于抗抑郁治療阻抗組(t=-2.055,P=0.070)、明顯高于正常對(duì)照組(t=4.946,P0.001)。小鼠大腦前額葉腹側(cè)MAPKAP1表達(dá)與GSK3B(r=0.463,P=0.046)、β-catenin(r=0.838,P0.001)表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系。(2)人群水平1)病例對(duì)照外周血檢測(cè)病例對(duì)照外周血MAPKAP1表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但病例組表達(dá)高于對(duì)照組,MAPKAP1與AKT1存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.427,P=0.001),與GSK3B存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.327,P=0.017),與β-catenin存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.359,P=0.008)。2)病例對(duì)照大腦海馬組織檢測(cè)MAPKAP1表達(dá)在病例中存在升高趨勢(shì)(t=-1.874,P=0.067),AKT1病例組大腦海馬組織表達(dá)明顯高于對(duì)照組(Z=-2.592,P=0.010)。3)病例對(duì)照大腦前額葉組織檢測(cè)病例對(duì)照大腦前額葉組織MAPKAP1表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但病例組表達(dá)高于對(duì)照組,MAPKAP1與AKT1存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.364,P=0.007)。結(jié)論:1、MAPKAP1基因可能是心境障礙的易感基因;通過(guò)(PI3K/Akt/mTORC2)通路發(fā)揮其神經(jīng)可塑性生物學(xué)功能參與心境障礙的發(fā)生、發(fā)展。2、心境障礙患者攜帶較高頻率的rs78809014G等位基因,且與臨床癥狀中有罪感和自殺相關(guān)。3、心境障礙患者存在MAPKAP1表達(dá)的異常,且與抗抑郁治療相關(guān)。MAPKAP1表達(dá)異常與臨床癥狀中阻滯因子(抑郁情緒)正相關(guān);MAPKAP1高表達(dá)者具有較差的即刻記憶。4、抑郁小鼠模型大腦前額葉腹側(cè)腦組織MAPKAP1高表達(dá)組抗抑郁治療效果好。
【圖文】：
山西醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文中消化1-2 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，，脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3ml此化；打后吸出，移入15 mL離心管中，在1000 rpm條件下離液，加入1 mL培養(yǎng)液后吹勻；事先準(zhǔn)備好的含有5 mL培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中或含有15培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
1例共病輕度智力低下 A25），1例雙相情感障礙患者 A21（先證者）。（注：追問(wèn)家族疾病狀況，A25的智力低下可能來(lái)源于外家系，因此分析數(shù)據(jù)時(shí)剔除A25和 A10）見(jiàn)圖2-1）圖 2-1 心境障礙患者家譜圖2.1.2 心境障礙患者主要臨床資料
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R749
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2620204
