【摘要】：ARF4是植物響應(yīng)生長素的轉(zhuǎn)錄因子,在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用。目前關(guān)于ARF基因啟動子的研究較少,并且在草莓中的研究還尚屬空白。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù),預(yù)測草莓ARF基因家族啟動子的順式作用元件,推測其基因的功能,并克隆草莓ARF4基因啟動子序列,將ARF4基因啟動子與GUS報告基因構(gòu)建為融合基因,通過不同處理來分析ARF4基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性,為全面揭示ARF4基因功能奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1.從草莓基因組網(wǎng)站中獲得了9條ARF基因啟動子序列,明確了其在草莓基因組中的具體位置。生物信息學(xué)分析顯示,它們不僅包含了核心作用元件,還含有大量的與光響應(yīng)、脅迫響應(yīng)、激素響應(yīng)及生理機(jī)制調(diào)控等相關(guān)的順式作用元件。ARF基因家族不同成員之間作用元件的數(shù)量和種類存在差異,不同成員間除包含自己特有的元件外,還存在一些共有的元件。2.從‘艷麗’草莓中克隆獲得ARF4基因啟動子序列。利用生物信息學(xué)在線軟件分析該序列發(fā)現(xiàn),該啟動子不僅含有TATA-box、CAAT-box,還存在多種順式作用元件,如光響應(yīng)元件sp1、Box 4等,厭氧誘導(dǎo)元件ARE,真菌誘導(dǎo)子響應(yīng)元件Box-W_1,蛋白代謝調(diào)節(jié)作用元件O_2-site,赤霉素應(yīng)答元件P-box等。在草莓栽培品種‘全明星’、‘甜查理’、‘阿爾比’和‘紅顏’中都克隆了ARF4基因啟動子序列,序列間未發(fā)現(xiàn)作用元件存在差異。3.以pRI 201-AN-GUS為基礎(chǔ)載體,將ARF4基因啟動子連接到該載體上,獲得草莓ARF4基因啟動子融合載體,命名為proARF4::GUS。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法,以森林草莓‘Ruegen’為材料,獲得了5株轉(zhuǎn)proARF4::GUS基因植株。利用農(nóng)桿菌侵花的轉(zhuǎn)化方法對擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,獲得5株轉(zhuǎn)基因植株。4.將ARF4基因啟動子進(jìn)行分段缺失克隆,分別構(gòu)建融合載體proARF4A::GUS、proARF4B::GUS,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的果實注射法,注射后通過GUS組織染色檢測發(fā)現(xiàn),隨著啟動子序列長度逐漸變短,proARF4B所驅(qū)動的GUS基因的表達(dá)最弱。5.對轉(zhuǎn)proARF4::GUS基因草莓植株進(jìn)行了GUS組織染色,發(fā)現(xiàn)在葉柄、嫩葉及新莖中GUS表達(dá)水平較高,在嫩葉中表達(dá)量最高。利用qRT-PCR方法分析了低溫、干旱、NaCl、不同激素種類、不同濃度等處理對轉(zhuǎn)基因植株中GUS基因表達(dá)的影響,結(jié)果表明在低溫、干旱及NaCl處理下,GUS基因的表達(dá)量影響不大;與IBA等其他激素相比,IAA能明顯提高GUS基因的表達(dá)量。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在10μmol·L~(-1) IAA處理12h下GUS基因的表達(dá)量最高。
【圖文】：

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文檢測后，挑選產(chǎn)生目的條帶的單菌落涂抹在帶有 Amp ，，37℃培養(yǎng)過夜。刮取二轉(zhuǎn)生長的菌落加到帶有 Amp 溫振蕩過夜，并送于北京華大基因公司進(jìn)行序列測定。GM-proARF4。 基因啟動子進(jìn)行序列分析NAMAN軟件將從草莓基因組網(wǎng)站下載的序列與克隆所用生物信息學(xué)在線軟件 Plant CARE 對克隆的啟動子序析。 基因啟動子載體的構(gòu)建 Pst Ⅰ 酶和 Xba Ⅰ 酶進(jìn)行雙酶切，將 ARF4 基因啟表達(dá)載體中的 35S 啟動子來啟動 GUS 基因的表達(dá)，植

2‘艷麗’草莓 DNA 電泳圖1-2：‘艷麗’草莓 DNAhoresis of DNAextracted from DNAextracted from strawberry ‘列信息，我們下載了 AR線軟件 Plant CARE 對序。模板，根據(jù)（表 8）中設(shè)計67 bp 的特異片段（如圖
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S668.4

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本文編號：2619932