【摘要】：表觀遺傳修飾(Epigenetic modification)是生物體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中調(diào)控基因表達(dá)的重要手段,甲基化和乙�；瞧渲凶钪匾膬煞N修飾方式,參與生物體的許多調(diào)控過(guò)程。小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一,其基因組龐大而復(fù)雜,目前其表觀遺傳學(xué)方面的研究還不多。5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶(DME)是植物體內(nèi)一種重要的去甲基化雙功能酶,參與植物體內(nèi)許多重要的生物過(guò)程。HD2基因家族是植物體內(nèi)特有的組蛋白去乙�；�(HDAC)亞家族,參與植物體多個(gè)器官組織的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程,同時(shí)在植物非生物脅迫響應(yīng)中具有重要作用。本研究通過(guò)構(gòu)建pUbi-DMEhp沉默質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因小麥植株,以沉默小DME基因的表達(dá),為進(jìn)一步研究小麥中DNA甲基化/去甲基化作用奠定一定的基礎(chǔ)。通過(guò)生物信息學(xué)方法鑒定小麥HD2基因家族所有成員,并對(duì)其基本生物學(xué)特性和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等進(jìn)行了分析,同時(shí)利用qRT-PCR方法對(duì)其在小麥不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期熱脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析;建過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建,為進(jìn)一步研究小麥HD2基因的作用以及利用其改良小麥品質(zhì)提供重要基礎(chǔ)。本研究獲得如下結(jié)果:1.以pHMW-DMEhp質(zhì)粒和pGEM-Ubi-GFP-nos為基礎(chǔ),通過(guò)一步克隆法構(gòu)建質(zhì)粒,構(gòu)建得到廣譜表達(dá)的DME基因發(fā)夾結(jié)構(gòu)沉默載體(pUbi-DMEhp)。2.將pUbi-DMEhp載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入小麥未成熟胚中,經(jīng)培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)基因小麥T_0代植株,PCR檢測(cè)得到5株陽(yáng)性植株。繼續(xù)種植得到T_1代,PCR檢測(cè)得到35株陽(yáng)性植株。3.利用HMMER和BLAST等生物信息學(xué)方法,鑒定得到12個(gè)小麥HD2基因,并對(duì)其等電點(diǎn)、亞細(xì)胞定位和蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量等信息進(jìn)行了預(yù)測(cè)。根據(jù)其蛋白質(zhì)C端是否具有鋅指結(jié)構(gòu)將其分為Group 1和Group 2,并結(jié)合其染色體位置信息對(duì)其命名。4.利用WheatExp網(wǎng)站,分析了小麥HD2基因在不同組織不同時(shí)期的表達(dá)量,根據(jù)結(jié)果取log 2值繪制熱圖。利用NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA-seq數(shù)據(jù),分析得到小麥HD2基因在熱脅迫、干旱脅迫以及熱脅迫加干旱脅迫下的表達(dá)模式。5.設(shè)計(jì)特異性引物,分別選取出芽3天和7天、分蘗、春化、起身、拔節(jié)、挑旗、抽穗、開(kāi)花、灌漿早期、灌漿晚期和成熟期十二個(gè)時(shí)期的小麥植株,進(jìn)行35℃/1h、42℃/1h處理。然后取其葉片進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),大多數(shù)小麥HD2基因在在挑旗期和抽穗期熱脅迫下表達(dá)量明顯上升,表明小麥HD2基因可能在小麥生長(zhǎng)發(fā)育的挑旗期和抽穗期對(duì)熱脅迫響應(yīng)具有重要作用。
【圖文】：

圖 2-1 雙酶切 pHMW-DMEhp 質(zhì)粒Fig2-1 Double digestion of plasmid pHMW-DMEhp定向克隆法設(shè)計(jì)引物，，擴(kuò)增 Ubi 啟動(dòng)子。Ubi 啟動(dòng)子長(zhǎng)度為 19設(shè)計(jì)引物后，在前后兩端分別加上 21 bp（補(bǔ)全酶切位點(diǎn)以及分）總長(zhǎng)度約 2018 bp。經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（如圖 2-2

的 5-甲基胞嘧啶 DNA 糖基化酶沉默子轉(zhuǎn)化和 HD2 基因家族圖 2-1 雙酶切 pHMW-DMEhp 質(zhì)粒Fig2-1 Double digestion of plasmid pHMW-DMEhp克隆法設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增 Ubi 啟動(dòng)子。Ubi 啟動(dòng)子長(zhǎng)引物后，在前后兩端分別加上 21 bp（補(bǔ)全酶切位總長(zhǎng)度約 2018 bp。經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（如
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S512.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 鄒宏達(dá);小—大麥2H染色體重組材料創(chuàng)制及外源基因在小麥背景中表達(dá)研究[D];吉林大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2618848