【摘要】：植物花青素是類黃酮物質(zhì)在生物合成中所產(chǎn)生的重要次生代謝產(chǎn)物,廣泛存在于植物體內(nèi)液泡中,是花卉、水果和蔬菜中的主要呈色物質(zhì)。黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)果皮和馬藺(Iris lactea Pall.varchinensis(Fisch.)Koidz,以下簡稱(I.lactea var chinensis)花瓣中都富含大量的花青素,而這兩種植物的花青素生物合成代謝機制目前尚未見報道。本文以黑果枸杞和馬藺為材料,提取黑果枸杞果皮和馬藺花瓣的RNA進行轉(zhuǎn)錄組測序,從中篩選出黑果枸杞和馬藺花青素生物合成途經(jīng)的關(guān)鍵基因并對其進行分離克隆和生物信息學(xué)特征分析;同時通過構(gòu)建原核細胞表達載體及體外酶活性測定分析馬藺二氫黃酮醇4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)基因的底物結(jié)合特性,并與荷蘭鳶尾、矮牽牛、煙草等植物的DFR基因的底物結(jié)合特性進行比較,明確馬藺DFR基因編碼的蛋白(酶)的底物偏好特性。本研究的研究結(jié)果如下:1.根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果,篩選得到了黑果枸杞花青素生物合成途徑中的7類關(guān)鍵基因,即查爾酮合酶(chalcone synthase,CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase,CHI)、黃烷酮 3-羥化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)、類黃酮 3'-羥化酶(flavonoid 3'-hydroxylase,F3'H)、類黃酮 3'5'-羥化酶(flavonoid3',5'-hydroxylase,F3'5'H)、二氫黃酮醇 4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)和花青素合酶(anthocyanidin 4-synthase,ANS)等基因(分別命名為 LrCHS、LrCHI、LrF3H、LrF3'H、LrF3'5'H、LrDFR 和 LrANS)以及馬藺花青素生物合成途徑中的1個關(guān)鍵基因,即二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)(命名為IlDFR)的序列。將其登錄到NCBI基因數(shù)據(jù)庫上,并對這些基因進行了生物信息學(xué)特征分析和克隆驗證。2.將馬藺IlDFR、荷蘭鳶尾IhDFR、矮牽牛PhDFR和煙草NtDFR基因構(gòu)建原核表達載體pTrc-CKS(多克隆酶切位點MCS下游含6×His-Taq標簽),并在大腸桿菌JM109中分別成功表達了 4種蛋白,利用鎳瓊脂糖凝膠填充柱親和層析法純化得到這4種目的蛋白。3.四種目的蛋白在NADPH的輔助作用下分別與二氫槲皮黃酮(dihydroquercetin,DHQ)、二氫山奈黃酮醇(dihydrokaempferol,DHK)和二氫楊梅黃酮(dihydromyricetin,DHM)三種底物在體外進行酶促反應(yīng),通過HPLC檢測發(fā)現(xiàn),馬藺IlDFR蛋白可以有效的催化DHK、DHM兩種底物,而基本不催化底物DHQ,并且對DHM的催化效率高于DHK;荷蘭鳶尾IhDFR蛋白可以有效地催化DHQ、DHK和DHM三種底物,對DHK、DHM的催化效率高于DHQ;矮牽牛PhDFR蛋白和煙草NtDFR蛋白可以有效的催化DHQ、DHK和DHM三種底物,并且其催化效率相差不大。馬藺IlDFR和荷蘭鳶尾IhDFR的底物特異性結(jié)構(gòu)域均為“TVKRVVFTSSAGTVDVKEHQQMEYDESSWSDVEFCRRV”,而矮牽牛 PhDFR、煙草NtDFR 的底物特異性結(jié)構(gòu)域分別為“TVKRLVFTSSAGTLDVQEQQKLFYDQTSWSDLDFIY AK”和“TVKRLVFTSSAGTLDA QEHQKLFYDETSWSDLDFIYAK”。第 3 個氨基酸殘基均為賴氨酸(K),帶負電荷,理論上這4種蛋白主要催化DHQ和DHM,而催化DHK的效率較低,但這4種蛋白對底物的偏好和催化效率都不盡相同,再次證明了該結(jié)構(gòu)域的其他氨基酸殘基也影響著DFR對底物的選擇。該研究為今后利用分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)定向培育花卉、水果和蔬菜的顏色提供新的基因資源和奠定技術(shù)基礎(chǔ)。
【圖文】：

從黑果枸杞果皮和馬藺花瓣中提取的總ＲＮＡ的ｒＲＮＡ２８Ｓ和１８Ｓ條帶清晰，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０逡逑（１．８－２．１）及ＯＤ２６０／ＯＤ２３０邋（大于２．０）值均介于正常值區(qū)間，表明提取的ＲＮＡ完整性比較好逡逑（圖２－１），可用于下一步的ｃＤＮＡ合成和轉(zhuǎn)錄組測序。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋１邐２逡逑：■逡逑５（＞°邋＿逡逑~栧義賢跡玻弊埽遙危燎碇悄旱纈懼義獻ⅲ海停海停幔潁耄澹潁玻埃埃埃唬歟漢詮坭焦ぷ埽遙危�；２：马蔺花瓣总＿b危鈴義希疲椋紓澹玻卞澹粒紓潁錚螅邋澹紓澹戾澹澹歟澹悖簦潁錚穡瑁錚潁澹螅椋簀澹錚駑澹簦錚簦幔戾澹遙危鈴義希危錚簦澹哄澹停哄澹停幔潁耄澹蟈澹玻埃埃埃誨澹保哄澹簦錚簦幔戾澹遙危鈴澹錚駑澹蹋澹潁酰簦瑁澹睿椋悖酰礤澹穡澹澹歟澹玻哄澹簦錚簦幔戾澹遙危鈴澹錚駑澹保澹歟幔悖簦澹幔戾澹穡澹簦幔歟義希玻玻埠詮坭焦ず吐磔ò曜甲椴廡蟈義蝦詮坭焦さ淖甲椴廡蚪峁�，获得了邋１０．８_澹牽忮澹茫歟澹幔鑠澹模幔簦�，邋Ｑ３０碱基百分比为９４４％。辶x獻樽昂蠊不竦昧隋澹罰�，０２４条Ｕｎｉ＜傚ｎｅ（非重甘[蛄謝潁Ｆ渲諧ざ仍冢卞澹耍庖隕系模眨睿椋紓澹睿逵胸罰擔梗沖義咸�。对諒T眨睿椋紓澹睿褰泄δ蘢⑹停ㄓ耄耍牛牽�、　肯、仰嶉ｓｓ－Ｐ}錚�、ＣＯＧ、Ｐ傖虎ＮＲ和ＫＯＧ辶x鮮菘獾謀榷�，共获得了邋，８条Ｕｎｉ＜傚ｎｅ的注释结果。采用Ｔ}幔睿螅模澹悖錚洌澹蛉砑げ獾玫攪蘇廡╁義希眨睿椋紓澹睿邋宓膩澹茫模渝逍蛄小ｅ義下磔ò甑淖甲椴廡蚪峁�，，获得了邋１１．４６邋　库邋Ｃe澹幔鑠澹模幔簦�，邋Ｑ３０碱基百分比为９４８％。组装辶x蝦蠊不竦昧隋澹矗

本文編號：2618800